Page 42 - 《中国药房》2025年23期
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2.2 分组、造模与给药                                        2.8 大鼠卵巢组织中Beclin-1、p62、LC3 mRNA表达检测
              将 40 只大鼠随机分为空白组、模型组、中药组和化                           采用 qRT-PCR 法检测。取“2.3”项下冻存的卵巢组
          学药组，每组10只。空白组大鼠以普通饲料喂养，其余                           织（每组取 3 个样本），加入 0.5 mL Monzol 升级款 RNA
          各组大鼠通过灌胃1 mg/kg来曲唑混悬液联合高脂饲料                         提取试剂充分研磨裂解，提取组织中总 RNA 并将其反
          喂养建立PCOS模型，连续21 d后进行阴道涂片检测，若                        转录合成 cDNA。以 cDNA 为模板，加入上、下游引物，
          镜下可见造模大鼠卵巢组织上皮细胞持续角化、卵泡                             按程序（95 ℃预变性 30 s；95 ℃变性 10 s，60 ℃退火/延
          GCs 层数明显减少、卵细胞放射冠消失或改变，则表明                          伸30 s，共40个循环）进行PCR扩增，根据扩增曲线和溶
                                              [7]
          大鼠出现动情周期紊乱，提示造模成功 。造模成功                             解曲线完成 qRT-PCR 检测。以 GAPDH 为内参，采用
          后，中药组、化学药组大鼠分别灌胃化痰通脉饮[24                            2 －ΔΔCt 法计算 Beclin-1、p62、LC3 mRNA 的表达水平。引
                 [6]
          g/（kg·d） ]、二甲双胍溶液[0.16 g/（kg·d），溶剂为1%羧甲             物序列由武汉金开瑞生物工程有限公司合成。引物序
                                                              列及扩增产物长度见表1。
                        [5]
          基纤维素钠溶液 ]，空白组和模型组大鼠按10 mL/（kg·d）
                                                                        表1 引物序列及扩增产物长度
          灌胃纯净水，每天1次，连续42 d。
          2.3 标本采集及处理                                         基因            引物序列（5′→3′）              扩增产物长度/bp
                                                              GAPDH         正向：ACAGCAACAGGGTGGTGGAC     155
              末次给药 24 h 后，按 0.04 g/kg 的剂量腹腔注射 2%                            反向：TTTGAGGGTGCAGCGAACTT
          戊巴比妥钠麻醉大鼠；取大鼠股动脉血 4 mL，于 4 ℃下                       Beclin-1      正向：TTGCCGTTGTACTGTTCT       165
          静置3 h后离心10 min（离心半径为10 cm，转速为3 500                                反向：AATCTTGCCTTTCTCCAC
                                                              p62           正向：TCCCTGTCAAGCAGTATCC      145
          r/min），存取上层血清，用于ELISA检测。
                                                                            反向：TCCTCCTTGGCTTTGTCTC
              取血后将大鼠处死，分离其双侧卵巢，反复冲洗后                          LC3           正向：ATAGAGCGATACAAGGGTG      140
          去除卵巢血管、表面膜等组织后得到卵巢组织。每组取                                          反向：AGGAAGAAGGCTTGGTTA
          4只大鼠的卵巢组织分别固定于4%多聚甲醛、戊二醛固                           2.9 大鼠卵巢组织中PI3K/AKT/mTOR通路及自噬相
          定液中，每组剩余6只大鼠的卵巢组织保存于－80 ℃冰                          关蛋白表达检测
          箱中，用于后续检测。                                              采用Western blot法检测。取“2.3”项下冻存的卵巢
          2.4 大鼠卵巢组织病理形态学观察                                   组织（每组取 3 个样本），加入裂解液后冷冻研磨，离心
              取“2.3”项下用4%多聚甲醛固定的卵巢组织，依次                      （温度4 ℃，转速12 000 r/min，半径10 cm）15 min后取上
          经过梯度乙醇脱水、二甲苯透明及石蜡包埋后，制备石                            清液。根据BCA试剂盒说明书对上清液中总蛋白进行
          蜡切片（厚 5 μm），最后进行苏木素-伊红（HE）染色，采                      定量，加入5×上样缓冲液煮10 min，冷却保存。取变性
          用光学显微镜进行病理形态学观察。                                    后蛋白上样进行电泳[浓缩胶的电压为 80 V，电泳时间
          2.5 大鼠卵巢组织超微结构观察                                    为 30 min；分离胶的电压为 120 V，电泳时间为 60 min
                                                             （其中 LC3 蛋白的电压为 110 V，电泳时间为 70 min）]、
              取“2.3”项下用戊二醛固定的大鼠卵巢组织，用 1%
                                                              转膜[电流为350 mA，转膜时间为40 min（其中LC3蛋白
          四氧化锇后固定，经丙酮梯度脱水及环氧树脂包埋后，
                                                              的转膜电流为 200 mA，转膜时间为 60 min）]、室温封闭
          制备成厚度约60 nm的超薄切片。切片依次经醋酸铀染
                                                              1 h（LC3 蛋白室温封闭 2 h）后，加入一抗 PI3K、p-PI3K、
          色10 min、柠檬酸铅染色2 min后，采用透射电子显微镜
                                                              AKT、mTOR、p-mTOR、Beclin-1、p62、LC3（稀释比例均
          进行图像采集和观察。
                                                              为 1∶1  000）以 及 p-AKT（稀 释 比 例 为 1∶2  000）和
          2.6 大鼠血清性激素水平检测
                                                              GAPDH（稀释比例为 1∶5 000），4 ℃孵育过夜；以 TBST
              取“2.3”项下血清，分别按照相应 ELISA 试剂盒说
                                                              洗膜 3 次后加二抗（稀释比例为 1∶10 000），室温孵育 1
          明书步骤操作，采用酶标仪检测血清中 T、E2、LH、FSH
                                                              h；又以 TBST 洗膜 3 次后加入 ECL 显影。使用 Image J
          水平并计算LH/FSH比值。
                                                              软件分析各蛋白条带的灰度值，以 p-PI3K 与 PI3K、p-
          2.7 大鼠卵巢组织中Beclin-1、p62蛋白表达检测
                                                              AKT与AKT、p-mTOR与mTOR条带的灰度值比值分别
              采用免疫荧光法检测。取“2.4”项下切片（每组取3                       表示PI3K、AKT和mTOR蛋白的磷酸化水平，以Beclin-
          个样本），放入 3% 柠檬酸修复液中高压修复 10 min，再                     1、p62 与内参蛋白（GAPDH）条带的灰度值比值表示
          加入3%双氧水作用20 min，然后在室温下以5%牛血清                        Beclin-1、p62蛋白的表达水平，以LC3-Ⅱ与LC3-Ⅰ条带
          白蛋白孵育30 min；分别滴加一抗（Beclin-1的稀释比例                    的灰度值比值表示LC3蛋白的表达水平。
          为 1∶150，p62 的稀释比例为 1∶100）工作液，在 4 ℃下孵                2.10 统计学方法
          育过夜；滴加荧光二抗（稀释比例为 1∶150），在 37 ℃下                         采用 SPSS 26.0 统计学软件进行数据处理与分析。
          孵育 30 min；滴加 DAPI 染色液，室温孵育 10 min，封片                本研究中所有计量资料均符合正态分布，以 x±s 表示；
          后通过荧光显微镜观察。Beclin-1、p62蛋白的阳性表达                      多组间比较采用单因素方差分析，方差齐性时组间两两
          呈红色荧光，采用 Image J 软件对阳性表达蛋白的荧光                       比较采用 LSD 检验，方差不齐时组间两两比较采用
          强度进行分析。                                             Games-Howell检验。检验水准α＝0.05。


          · 2920 ·    China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 23                            中国药房  2025年第36卷第23期
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