Page 52 - 《中国药房》2025年22期
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低剂量（红景天苷-L）组、红景天苷高剂量（红景天苷-H）                       （interleukin-6，IL-6）和肿瘤坏死因子 α（tumor necrosis
          组、红景天苷-H+抑制剂组，每组10只。红景天苷-L组、                        factor-α，TNF-α）mRNA的表达水平。反应体系（20 μL）
          红景天苷-H 组大鼠分别腹腔注射 50、100 mg/kg 的红景                   包含 10 μL 2×qPCR Mix 1、1 μL cDNA 模板、正反向引
              [10]
          天苷 ，红景天苷-H+抑制剂组大鼠腹腔注射100 mg/kg                      物各0.4 μL、8.2 μL RNase-free ddH2O。扩增条件：95 ℃
                                       [11]
          的红景天苷和0.1 µmol/kg的H-89 ，正常组和放射组大                    预变性 3 min；95 ℃变性 10 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸
          鼠均腹腔注射等体积生理盐水，每日1次，连续40 d。                          30 s，共 40 个循环；最后 72 ℃终延伸 5 min，4 ℃保存。
          2.2 血清中ROS、cAMP、SOD、淀粉酶水平检测                         引物由生工生物工程（上海）股份有限公司提供，IL-6正
              末次给药后，取各组大鼠腹主动脉血，于 4 ℃下                         向序列为5′-CATCCTCGACGGCATCTCAG-3′，反向序
          3 000 r/min离心15 min，收集上清液，按照试剂盒说明书                  列为 5′-TCACCAGGCAAGTCTCCTCA-3′，产物大小
          操作，使用酶标仪检测血清中 ROS、cAMP、SOD 水平，                      为 186 bp；TNF-α 正向序列为 5′-CCCATGTTGTAGCA-
          使用全自动生化分析仪检测血清中淀粉酶水平。                               AACCCTC-3′，反向序列为 5′-GCTGGTTATCTCTCA-
          2.3 腮腺组织病理学观察                                       GCTCCAC-3′，产物大小为 225 bp；β-actin 正向序列为
              取血后，分离各组大鼠腮腺组织，取部分腮腺组织                          5′-CGTAAAGACCTCTATGCCAACA-3′，反向序列为
          固定在4%甲醛溶液（pH 7.0）中，用梯度乙醇脱水，然后                       5′-TAGGCCAGGGCAGTAATC-3′，产物大小为154 bp。
          用二甲苯处理、包埋、切片（5 μm），再用苏木精溶液染色                        2.7 腮腺组织中 Col Ⅲ、VIP、PKA、p-PKA 蛋白表达
          5 min，伊红溶液染色 3 min，最后用梯度乙醇脱水、二甲                     检测
          苯透明、中性树胶封片。在显微镜下观察各组大鼠腮腺                                将“2.3”项下各组大鼠的腮腺组织，加入 RIPA 缓冲
          组织病理学变化。                                            液进行匀浆，超声处理至均匀，离心后取上清液测定蛋

          2.4 腮腺组织中Bax和Bcl-2表达检测                              白浓度，随后煮沸变性。每孔上样30 μg变性蛋白，经电
              取“2.3”项下各组大鼠的腮腺组织切片，经二甲苯和                       泳分离后，转膜，加入 Col Ⅲ、VIP、PKA、p-PKA、β-actin
          梯度乙醇常规脱蜡、水化后，用3%过氧化氢溶液中和非                           抗体（稀释比例分别为 1∶500、1∶1 000、1∶500、1∶1 000、
          特异性过氧化物酶活性，并在柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）                        1∶1 000），4 ℃孵育过夜；次日，加入相应二抗（稀释比例
          中加热诱导抗原修复。切片经山羊血清封闭后，加入                             为1∶2 000），室温下孵育1.5 h；显影后，使用凝胶成像系
          Bax、Bcl-2 抗体（稀释比例均为 1∶200），于 4 ℃孵育过                 统采集信号，使用Image J软件分析条带的灰度值，以目
          夜；加入二抗，室温孵育1 h，随后加入新鲜制备的3，3′-                       的蛋白与内参蛋白（β-actin）的灰度值比值评价目的蛋白
          二氨基联苯胺溶液进行显色，再经复染、脱水、透明、封                           的表达水平，并以 p-PKA 与 PKA 的比值评价 PKA 的磷
          片后，在显微镜下随机选取视野，使用 Image-Pro Plus                    酸化水平。
          6.0软件计算目的蛋白的光密度值，以反映表达水平。                           2.8 统计学分析
          2.5 腮腺组织细胞凋亡情况检测                                        采用SPSS 27.0软件进行统计分析。符合正态分布
              取“2.3”项下各组大鼠的腮腺组织切片，在室温下用                       且方差齐性的计量资料以x±s表示，多组间比较采用单
          过氧化氢处理以淬灭内源性过氧化物酶，蛋白酶K消化                            因素方差分析，进一步两两组间比较采用 SNK-q 检验。
          去除组织蛋白，随后在 37 °C 下暴露于 TUNEL 溶液中，                    检验水准α＝0.05。
          加入3，3′-二氨基联苯胺溶液显色，洗涤后用1%盐酸乙                         3 结果
          醇溶液浸泡，自来水返蓝，常规脱水、透明、封片，在显微                          3.1 红景天苷对大鼠血清中ROS、cAMP、SOD、淀粉酶
          镜下随机选取视野，统计TUNEL阳性数量（显棕黄色），                         水平的影响
          并计算其在该视野总细胞数中的占比，作为细胞凋                                  与正常组比较，放射组大鼠血清中ROS和淀粉酶水

          亡率。                                                 平均显著升高，cAMP 和 SOD 水平均显著降低（P＜
          2.6  腮 腺 组 织 中 白 细 胞 介 素 6 和 肿 瘤 坏 死 因 子 α          0.05）；与放射组比较，红景天苷-L组和红景天苷-H组大
          mRNA表达检测                                            鼠血清中ROS和淀粉酶水平均显著降低，cAMP和SOD
              取“2.3”项下各组大鼠的腮腺组织，采用Trizol法提                    水平均显著升高（P＜0.05），且红景天苷-H 组改善更明
          取总RNA并检测其浓度与纯度，随后取1 μg总RNA反                         显（P＜0.05）；与红景天苷-H 组比较，红景天苷-H+抑制
          转录合成 cDNA。以合成的 cDNA 为模板进行 PCR 扩                     剂组大鼠血清中ROS 和淀粉酶水平均显著升高，cAMP
          增。以 β-actin 为内参，采用 2      －ΔΔCt 法计算白细胞介素 6          和SOD水平均显著降低（P＜0.05）。结果见表1。


          · 2798 ·    China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 22                            中国药房  2025年第36卷第22期
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