Page 29 - 《中国药房》2025年19期
P. 29

素消毒，并用可吸收线和丝线缝合，最后涂抹红霉素软                           2.2.5 神经元形态观察与NeuN蛋白免疫组化检测
          膏 。Sham组小鼠不摘除卵巢，其余处理与各造模组小                             末次给药后禁食 24 h，将小鼠（每组取 3 只）用 10%
            [13]
          鼠相同。术后进行动情周期检测，若阴道涂片显示无正                           戊巴比妥钠完全麻醉后置于解剖台上，取出全脑用 4%
          常动情周期变化或动情周期紊乱表明小鼠进入围绝经                            多聚甲醛固定 24 h，制备小鼠海马石蜡切片（厚 4 μm），
                         [14]
          期，提示造模成功 。本研究用于造模的50只小鼠均造                          进行苏木精-伊红（HE）染色。将染色后的切片脱水透
          模成功。                                               明，用中性树胶封片后，用 VS200 型数字切片扫描仪扫
          2.2.3 给药                                           描并观察组织病理学变化。另取小鼠海马石蜡切片进
              造模成功后，Sham 组和 OVX 组小鼠灌胃生理盐                     行免疫组化染色，先用pH6.0的柠檬酸盐缓冲液在高温、
          水；ZSD-L、ZSD-M、ZSD-H组小鼠分别灌胃ZSD水煎液                   高压下进行抗原修复，然后用 5% 牛血清白蛋白在室温

          11、22、33 g/kg，分别为临床等效剂量的1、2、3倍；ESZ组                下封闭30 min；加入NeuN一抗（稀释比例1∶10 000），在
          小鼠灌胃右佐匹克隆1 mg/kg（以水为溶剂）。连续灌胃                       4 ℃湿盒中孵育过夜；磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤后，加入
          3周，每天1次，灌胃体积均为10 mL/kg。                            HRP 标记的山羊抗兔免疫球蛋白 G 二抗（稀释比例 1∶
          2.2.4 睡眠潜伏期及睡眠持续期检测                                200），在室温下孵育1 h后，DAB显色，苏木精复染，脱水
              采用戊巴比妥钠睡眠协同实验检测。给药结束前                          透明，并用中性树胶封片，显微镜观察并采集图像。采
          1 d（灌胃结束1 h后），腹腔注射戊巴比妥钠（50 mg/kg），                 用 Image J 软件对小鼠海马 CA1 区 NeuN 蛋白阳性表达
          记录每只小鼠翻正反射消失和恢复的时间。睡眠潜伏                            区域（呈黄褐色或棕黄色）进行光密度分析，并计算
          期指从注射戊巴比妥钠到翻正反射消失的时间，睡眠持                           NeuN的平均光密度值（平均光密度值＝累积光密度值/
          续期指翻正反射消失和恢复的时间间隔。采用 Graph‐                        区域面积×100%）。
          Pad Prism 8软件进行统计分析；符合正态分布的计量资                         HE 染色结果（图 1）显示，Sham 组小鼠神经元细胞
          料以 x±s 表示；多组间比较采用单因素方差分析，进一                        条理清晰、分布整齐，细胞核与细胞膜结构完整，细胞数
          步组间两两比较采用 LSD-t 检验；检验水准 α＝0.05（后                   量较多；与 Sham 组比较，OVX 组小鼠神经元细胞排列
          文各指标的统计分析方法均同此处）。                                  不规整，细胞膜边缘模糊，细胞数量减少，神经元出现了
              结果（表1）显示，与Sham组比较，OVX组小鼠的睡眠                    明显的损伤；与OVX组比较，各给药组小鼠神经元损伤
          潜伏期显著延长（P＜0.01），睡眠持续期显著缩短（P＜
                                                             明显改善，细胞结构完整。免疫组化染色结果（图 1）显
          0.01）；与OVX组比较，各给药组小鼠的睡眠潜伏期均显
                                                             示，与 Sham 组[（20.782±0.589）%]比较，OVX 组小鼠海
          著缩短（P＜0.01），睡眠持续期均显著延长（P＜0.01）。
                                                             马 CA1 区 NeuN 平均光密度值[（13.232±0.685）%]显著
         表1 各组小鼠的睡眠潜伏期和睡眠持续期测定结果比                            降低（P＜0.01）；与OVX组比较，ZSD-L、ZSD-M、ZSD-H
               较（x±s，n＝10，s）                                 组和 ESZ 组小鼠海马 CA1 区 NeuN 平均光密度值[分别
          组别                睡眠潜伏期             睡眠持续期          为（20.680±1.463）% 、（20.338±1.140）% 、（18.377±
          Sham组             298.50±66.65     5 029.75±1 806.70  0.614）%、（20.699±0.246）%]均显著升高（P＜0.01）。
          OVX组              482.50±89.43 a   673.50±103.72 a
          ZSD-L组            313.38±41.58 b   3 016.63±744.18 b  2.2.6 海马组织转录组测序分析差异表达基因
          ZSD-M组            358.50±59.00 b   3 166.63±897.14 b   根据前面的实验确定 ZSD 的低剂量为最佳有效剂
          ZSD-H组            353.13±56.62 b   3 496.25±384.42 b
          ESZ组              307.00±66.65 b   2 967.75±786.52 b  量，故本研究选择 ZSD-L 组的样本进行后续研究。取
             a：与Sham组比较，P＜0.01；b：与OVX组比较，P＜0.01。             Sham 组、OVX 组、ZSD-L 组小鼠各 3 只，处死后取脑内


           HE染色



           NeuN免疫组化染色





                A. Sham组        B. OVX组         C. ZSD-L组       D. ZSD-M组        E. ZSD-H组        E. ESZ组
            注：箭头所指表示神经元细胞变形损伤。
                                 图1 各组小鼠海马组织HE染色和NeuN免疫组化染色结果


          中国药房  2025年第36卷第19期                                              China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 19    · 2375 ·
   24   25   26   27   28   29   30   31   32   33   34