Page 52 - 《中国药房》2025年17期
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按ELISA试剂盒说明书方法操作检测血清中CK、LDH、                        3 结果
          AST含量。                                              3.1 生脉散对小鼠体重和中医证候评分的影响
          2.7 小鼠心肌组织病理学形态观察                                       造模前，各组小鼠的体重和中医证候评分差异均无
              取血完成后，开胸剪下小鼠心脏，每组取5只小鼠的                         统计学意义（P＞0.05）。与造模前同组相比，除空白组
          部分心肌组织（剩余部分冻存备用）置于4%多聚甲醛中                           外，其余各组小鼠给药 5 周后，体重均显著降低（P＜
          固定；经梯度乙醇脱水、透明后，包埋制成蜡块，再切成                           0.05），中医证候评分均显著升高（P＜0.05）。给药 5 周
          5 μm 薄片，贴于载玻片上，烘干 24 h 后脱蜡；取部分切                     后，与空白组相比，模型组小鼠体重显著降低（P＜
          片进行 HE 染色，经脱水、封片后，置于显微镜下观察并                         0.05），中医证候评分显著升高（P＜0.05）；与模型组相
          拍照。另取部分切片进行Masson染色，同法处理后，置                         比，生脉散各剂量组和阳性对照组小鼠体重均显著升高
          于显微镜下观察并拍照。                                        （P＜0.05），中医证候评分均显著降低（P＜0.05）。结果
          2.8 小鼠心肌细胞凋亡情况检测                                    见表2。
              取“2.7”项下剩余切片，加入 200 μL 蛋白酶 K 消化                 表2 各组小鼠体重和中医证候评分比较（x±s，n＝8）
          10 min，加入脱氧核苷酸转移酶、荧光标记的脱氧尿苷三                        组别                体重/g            中医证候评分/分
                                                                           造模前     给药5周后     造模前      给药5周后
          磷酸孵育2 h，再先后置于37 ℃封闭液中孵育30 min和                      空白组         24.8±0.5  26.6±0.7  0.10±0.05  0.10±0.09
          荧光标记的地高辛抗体中孵育 30 min；封片，采用显微                        模型组         24.6±0.4  19.5±0.6 ab  0.15±0.09  1.48±0.20 ab
                                                              阳性对照组       24.2±0.4  20.0±0.8 abc  0.18±0.04  0.88±0.11 abc
          镜观察并拍照（染色后细胞核呈蓝色，凋亡细胞呈绿
                                                              生脉散高剂量组     24.6±0.5  23.0±0.9 abc  0.13±0.05  0.75±0.23 abc
          色），利用Image J软件分析细胞凋亡情况并计算凋亡率                        生脉散中剂量组     24.5±0.5  23.0±0.8 abc  0.15±0.05  0.60±0.16 abc
         （凋亡率＝凋亡细胞数/总细胞数×100%）。                               生脉散低剂量组     24.4±0.5  21.8±0.5 abc  0.20±0.06  1.03±0.31 abc
                                                                 a：与造模前同组相比，P＜0.05；b：与空白组相比，P＜0.05；c：与模
          2.9  小 鼠 心 肌 组 织 中 Bcl-2、Cleaved-caspase-3、Bax
                                                              型组相比，P＜0.05。
          mRNA的表达检测
                                                              3.2 生脉散对小鼠行为学的影响
              取“2.7”项下各组冻存的心肌组织（n＝5）适量，加入
                                                                  与空白组相比，模型组小鼠旷场行动总距离、游泳
          Trizol 试剂低温研磨，提取并纯化 RNA，再逆转录得到
                                                              力竭时间均显著缩短（P＜0.05），木僵时间百分比显著
          cDNA。以cDNA 为模板进行PCR扩增反应：96 ℃预变
                                                              升高（P＜0.05），提示造模成功。与模型组相比，生脉散
          性5 min；93 ℃变性30 s、58 ℃退火/延伸30 s，共35个循               各剂量组小鼠旷场行动总距离和各给药组小鼠游泳力
          环；循环结束后，74 ℃延伸5 min，结束反应。以GAPDH                     竭时间均显著延长（P＜0.05），各给药组小鼠木僵时间
          为内参，采用2     －ΔΔCt 法计算各目的基因的相对表达量。                   百分比均显著降低（P＜0.05）。结果见表3。
          2.10 小鼠心肌组织中 RyR2、PLB 蛋白磷酸化水平                         表3 各组小鼠行为学相关指标比较（x±s，n＝8）
          检测                                                  组别            旷场行动总距离/cm  木僵时间百分比/%   游泳力竭时间/s
              取“2.7”项下各组冻存的心肌组织（n＝3）适量，加入                     空白组            617.3±153.9  36.1±8.0   716.6±79.6
                                                              模型组            372.7±54.2 a  69.5±6.0 a  247.6±39.6 a
          裂解液低温研磨，提取组织中总蛋白，经纯度检测后，加
                                                              阳性对照组          455.6±104.5  45.2±6.4 b  406.1±44.4 b
          入适量上样缓冲液煮沸变性；取变性后蛋白进行十二烷                            生脉散高剂量组        621.7±101.5 b  43.1±6.4 b  654.8±77.6 b
          基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，采用湿法将蛋白印迹                            生脉散中剂量组        700.9±125.8 b  33.6±5.0 b  650.9±61.2 b
                                                              生脉散低剂量组        645.4±79.1 b  43.0±6.9 b  473.3±34.9 b
          转到聚偏二氟乙烯膜上，以封闭液封闭；加入 RyR2、
                                                                 a：与空白组相比，P＜0.05；b：与模型组相比，P＜0.05。
          PLB、p-PLB、p-RyR2、β-actin一抗（稀释度均为1∶500）在
                                                              3.3 生脉散对小鼠心功能的影响
          4 ℃下孵育过夜，次日加入二抗（稀释度为 1∶10 000）在                         与空白组相比，模型组小鼠的心率、LVESD、左心室
          室温下孵育1 h；加入化学发光液显影，使用Image J软件                      质量指数、全心质量指数均显著升高（P＜0.05），LVEF、
          对蛋白图像进行灰度值分析。以目的蛋白与内参蛋白                             LVEDD 均显著降低（P＜0.05）。与模型组相比，各给药
         （β-actin）条带灰度值的比值表示目的蛋白的表达水平，                        组小鼠的心率、LVESD、左心室质量指数、全心质量指数
          以 p-RyR2 与 RyR2、p-PLB 与 PLB 的灰度值比值表示                均显著降低（P＜0.05），LVEF（生脉散低剂量组除外）均
          RyR2、PLB蛋白的磷酸化水平。                                   显著升高（P＜0.05）。结果见表4。
          2.11 统计学方法                                          3.4 生脉散对小鼠血清中CK、LDH、AST含量的影响
              采用SPSS 25软件进行统计分析。当数据满足正态                           与空白组相比，模型组小鼠血清中 CK、LDH、AST
          分布时，以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，                          含量均显著升高（P＜0.05）。与模型组相比，阳性对照
          进一步组间两两比较采用 LSD-t 检验；造模前后同组间                        组和生脉散中、高剂量组小鼠血清中 CK、LDH、AST 含
          两两比较采用配对t检验。检验水准α＝0.05。                             量均显著降低（P＜0.05）。结果见表5。


          · 2130 ·    China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 17                            中国药房  2025年第36卷第17期
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