Page 66 - 《中国药房》2025年13期
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2.3 大鼠血浆中PRL水平测定 模式喷雾电压为－3.0 kV；包覆气压力为40 arb；辅助气
采用 ELISA 法测定。末次给药后，将大鼠麻醉（腹 流压力为10 arb；毛细管温度为320 ℃；二级扫描为数据
腔注射戊巴比妥钠），收集其腹主动脉血5 mL，置于抗凝 依赖性扫描。
管中，在 4 ℃下以 3 000 r/min 离心 10 min，分离血浆，使 2.5.3 代谢组学分析
用酶标仪于 450 nm 波长处检测血浆中 PRL 水平，严格 取“2.5.1”项下样品溶液，按“2.5.2”项下条件进样分
按照试剂盒说明书操作。 析，所得质谱数据通过 Compound Discoverer 3.1 软件进
2.4 大鼠肠道菌群分析 行处理，并进行偏最小二乘法-判别分析（partial least
2.4.1 样本采集与DNA提取 squares-discriminant analysis，PLS-DA）和正交偏最小二
末次给药后，随机选择每组6只大鼠，轻挤其尾巴根 乘法-判别分析（orthogonal partial least squares discrimi‐
部取粪便，置于无菌冻存管中，经液氮速冻后于－80 ℃ nant analysis，OPLS-DA），以变量投影重要性（variable
下保存。取上述粪便样品，采用 DNA 试剂盒提取肠道 importance in projection，VIP）＞1且P＜0.05为标准筛选
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菌群DNA，经2%琼脂糖凝胶电泳分析测定DNA纯度。 差异代谢物 。
2.4.2 PCR扩增、文库构建及高通量测序 2.5.4 通路富集分析
以所提 DNA 作为模板，扩增 16S rRNA 基因的 V3+ 对“2.5.3”项下所得差异代谢物进行京都基因和基
V4区。V3上游引物序列为5′-ACTCCTACGGGNGGC- 因组数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，
WGCAG-3′，V4 下游引物序列为 5′-GGACTACHVG- KEGG）代谢通路富集分析，以 P＜0.05 表示通路显著
GGTATCTAAT-3′。产物经纯化、定量后，使用 Illumina 富集。
DNA 建库试剂盒构建测序文库，并进行高通量测序分 2.6 粪便差异代谢物与差异菌群的相关性分析
析。测序分析由广州基迪奥生物科技有限公司完成。 采用 R 4.2.3 软件对大鼠肠道差异菌群与类固醇差
2.4.3 生物信息学分析 异代谢产物进行Spearman相关性分析，探讨肠道微生物
采用 R 4.2.3 软件对测序数据进行肠道菌群的 α 多 与其代谢物之间的相关性，结果以热图呈现。
样性、β 多样性、物种组成（门/属水平）、微生物组学 2.7 统计学分析
LEfSe分析。其中，α多样性以Simpson、Chao1、Shannon 采用SPSS 26.0软件对数据进行统计分析。满足正
指数为检测指标，β 多样性采用主坐标分析（principal 态分布的计量资料以x±s表示，多组间比较采用方差分
co-ordinates analysis，PCoA），物种组成以相对丰度作为 析，进一步两两比较采用Tukey事后检验；不满足正态分
检测指标，以线性判别分析（linear discriminant analysis， 布的计量资料以 M（P25，P75 ）表示，多组间比较采用非参
LDA）效应值（LDA 阈值为 2，P＜0.05）筛选各组间差异 数 Kruskal-Wallis H 检验，进一步两两比较采用 Mann-
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具有统计学意义的菌群标志物 。 Whitney U检验。检验水准α＝0.05。
2.5 粪便非靶向代谢组学分析 3 结果
2.5.1 样品制备 3.1 芍药苷对HPRL大鼠血清PRL水平的影响
取“2.4.1”项下冻存的各组大鼠的粪便样本，称取 与空白对照组[（20.42±1.38）ng/mL]比较，奥氮平
50 mg，置于含有80％甲醇300 μL的EP管中，以液氮速 组大鼠血清 PRL 水平[（53.54±4.71）ng/mL]显著升高
冻5 min后，在冰上融化、涡旋30 s，再超声6 min；于4 ℃ （P＜0.05），表明造模成功。与奥氮平组比较，芍药苷组
下以5 000 r/min离心1 min，取上清液至另一EP管中，冻 大 鼠 血 清 PRL 水 平 [（24.66±3.15）ng/mL] 显 著 降 低
干成粉；取上述冻干粉适量，以10%甲醇溶液溶解，进行 （P＜0.05）。
液相色谱-串联质谱分析。 3.2 芍药苷对HPRL大鼠肠道菌群的影响
2.5.2 色谱与质谱条件 3.2.1 肠道菌群多样性分析结果
色谱柱为 Hypersil Gold C18 （100 mm×2.1 mm，1.9 α 多样性分析结果（图 1A～C）显示，奥氮平组大鼠
μm）；流动相A为水、25 mmol/L乙酸铵、25 mmol/L氨水 Chao1、Simpson、Shannon 指数均显著高于空白对照组
混合溶液（体积比为 94∶5∶1），流动相 B 为乙腈，进行梯 （P＜0.05）；芍药苷组大鼠上述指数均显著低于奥氮平
度洗脱（0～0.5 min，95%B；0.5～7 min，95%B→65%B； 组（P＜0.05）。PCoA结果（图1D）显示，与空白对照组比
7～9 min，65%B→40%B；9～9.1 min，40%B→95%B； 较，奥氮平组大鼠的肠道菌群分布发生了明显偏移（P＜
9.1～12 min，95%B）；柱温为 25 ℃；流速为 0.5 mL/min； 0.05）；而芍药苷组大鼠的肠道菌群分布更趋向于与空白
进样量为2 μL。 对照组一致（P＞0.05）。上述结果表明，芍药苷的干预
采用电喷雾离子源进行正负离子扫描，扫描范围为 能够恢复奥氮平所致HPRL大鼠的肠道菌群失调，使其
m/z 100～1 500；正离子模式喷雾电压为 3.2 kV，负离子 α多样性和β多样性向空白对照组趋近。
· 1612 · China Pharmacy 2025 Vol. 36 No. 13 中国药房 2025年第36卷第13期
