Page 35 - 《中国药房》2025年12期
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线并计算曲线下面积（area under the curve，AUC）以反映             作为指标进行组间比较；绘制火山图，以表达量差异倍
          葡萄糖耐量（两者成正比）。于给药的第19周末，各组小                         数（fold change，FC）≥1.5、P＜0.05为标准筛选血清差异
          鼠禁食 12 h 后进行胰岛素耐量试验，具体操作如下：各                       代谢物，并通过韦恩图筛选共同差异代谢物。以上述差
          组小鼠腹腔注射0.15 IU/mL胰岛素溶液（以生理盐水为                      异代谢物通过京都基因和基因组数据库（Kyoto Ency‐
          溶剂，每 40 g 体重注射 200 μL），并于注射后 0、15、30、              clopedia of Genes and Genomes，KEGG；https：//www.ge‐
          60、90、120 min 时采集尾静脉血；使用血糖仪检测上述
                                                             nome.jp/kegg/）进行通路富集分析。
          时间点的血糖值，绘制血糖浓度-时间曲线并计算 AUC
                                                             2.3.2 小鼠肝组织中 AMPK 信号通路相关蛋白表达的
          以反映胰岛素耐量（两者成正比）。末次给药后，使用血
                                                             检测
          糖仪检测各组小鼠的FBG水平。
                                                                 取 NC 组、HFD 组、HGQZ-YP-H 组、HGQZ-KL-H 组
          2.2.3 样本采集及器官指数的计算
                                                             小鼠肝组织适量，匀浆，于4 ℃下以12 000 r/min离心15
              末次给药后，各组小鼠禁食、不禁水16 h后称重，随
                                                             min；取上清液，用 BCA 法测定蛋白浓度后加热变性。
          后以戊巴比妥钠麻醉后经眼球取血。血样于室温下静
                                                             取变性蛋白适量，经 10% 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺
          置30 min后，于4 ℃下以3 000 r/min离心15 min，分离上
          层血清并于－80 ℃下冻存，备用。取血后，各组小鼠以                         凝胶电泳分离后转移至聚偏二氟乙烯膜上，以 5% 牛血
          颈椎脱臼法处死，分离肝脏、白色脂肪、棕色脂肪并称                           清白蛋白于室温下封闭 1.5 h；加入 AMPK、p-AMPK、
          重，并计算器官或脂肪指数——肝指数、白色脂肪指数                           GAPDH一抗（稀释度分别为1∶1 000、1∶1 000、1∶5 000），
          和棕色脂肪指数。器官或脂肪指数＝器官或脂肪质量/                           于 4 ℃下孵育过夜；用 TBST 洗膜后，加入相应二抗（稀
          体重。随后，取肝组织样品适量，经液氮速冻后于－80 ℃                        释度为1∶5 000），于室温下孵育1 h；用TBST洗膜后，滴
          冻存，剩余组织样品则以4%多聚甲醇溶液固定，备用。                          加显色液后显影、成像。使用 Image J 软件分析各蛋白
          2.2.4 小鼠脂质与肝功能指标的检测                                的 条 带 灰 度 值 ，以 AMPK、p-AMPK 与 内 参 蛋 白
              取“2.2.3”项下各组小鼠肝组织样品适量，匀浆后，                    （GAPDH）的条带灰度值比值表示目的蛋白的相对表达
          检测其 TC、TG 水平；取“2.2.3”项下各组小鼠的血清样                    量，并以p-AMPK与AMPK蛋白的相对表达量比值表示
          品适量，检测其 AST、ALT 水平。严格按照相应试剂盒                       AMPK蛋白的磷酸化水平。
          说明书操作。                                             2.4 统计学方法
          2.2.5 小鼠肝组织病理形态学和脂质堆积情况观察
                                                                 采 用 SPSS  26.0 软 件 进 行 数 据 统 计 分 析 ，采 用
              取“2.2.3”项下各组小鼠经 4% 多聚甲醛溶液固定
                                                             GraphPad Prism 8 软件绘制图表。符合正态分布的计
          24 h的肝组织，取一部分经脱水、石蜡包埋后切片，再进
                                                             量资料以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，
          行苏木精-伊红（HE）染色，以甘油封片后，使用显微镜观
                                                             进 一 步 两 两 比 较 采 用 LSD-t 检 验（方 差 齐 性 时）或
          察其肝组织病理损伤状况；取另一部分肝组织用OCT包
                                                             Tamhane’s T2检验（方差不齐时）。检验水准α＝0.05。
          埋剂包埋后行冷冻切片，再进行油红 O 染色，使用显微
          镜观察其脂质堆积情况（脂质经染色后呈红色）。                             3 结果
          2.3 HGQZ饮片汤剂与配方颗粒潜在作用机制分析                          3.1 HGQZ饮片汤剂与配方颗粒的特征成分含量比较
          2.3.1 小鼠血清代谢组学研究                                   结果
              取 HFD 组、HGQZ-YP-H 组、HGQZ-KL-H 组（参考             3.1.1 方法学考察结果
         “2.2”项下药效学实验结果）小鼠血清样品适量，置于                              人参皂苷 Rb1、香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷、
          1.5 mL离心管中，加入400 μL乙腈-甲醇混合溶液（1∶1，                  金丝桃苷、荷叶碱、23-乙酰泽泻醇B检测质量浓度的线
          V/V），涡旋 30 s，于－20 ℃下静置 1 h 后，再于 4 ℃下以              性 范 围 均 为 0.72～285.74  μg/mL（相 关 系 数 均 大 于
          12 000 r/min 离心 15 min，取上清液，真空浓缩至干。残               0.99）。结果见表 2。该方法的专属性、精密度、加样回
          渣以50%乙腈100 μL复溶，涡旋30 s，于4 ℃下以12 000                收率、稳定性均符合2020年版《中国药典》（四部）的相关
          r/min 离心 15 min，取上清液 5 μL 进行 LC-MS/MS 分析
                                                             规定（具体结果略）。
         （检测仪器和条件均由美国AB SCIEX公司提供）。使用
                                                             表2 HGQZ中6个特征成分定量分析的线性关系考察
          Analyst 1.6.3 软件进行色谱、质谱数据采集，Multiquant
                                                                  结果
          3.0.3 软件用于代谢物分析。将所得数据导入 Metabo‐
                                                              特征成分                  标准曲线方程            相关系数
          Analyst 6.0 平台（https：//www.metaboanalyst.ca），采用正    人参皂苷Rb 1             y＝2.0×10 x+0.2×10 3  0.993 6
                                                                                       4
          交 偏 最 小 二 乘 法 - 判 别 分 析（orthogonal  partial  least   香蒲新苷                y＝4.1×10 x+1.3×10 3  0.999 1
                                                                                       4
                                                                                       4
                                                              异鼠李素-3-O-新橙皮苷        y＝6.0×10 x+4.0×10 3  0.995 4
                                                2
          squares discriminant analysis，OPLS-DA），以 R Y（表示模
                                                                                       4
                                                              金丝桃苷                 y＝5.1×10 x+0.9×10 3  0.997 1
                                                    2
          型解释率，数值越接近于1表示差异性越大）和Q（表示                           荷叶碱                  y＝2.2×10 x+8.4×10 4  0.992 4
                                                                                       5
          模型预测能力，数值越接近于1表示模型的可靠性越高）                           23-乙酰泽泻醇B            y＝3.0×10 x-0.7×10 3  0.995 5
                                                                                       4
          中国药房  2025年第36卷第12期                                              China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 12    · 1445 ·
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