Page 28 - 《中国药房》2025年12期
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2.4 神经组织病理学形态的观察                                    阵；随后，借助数据质量检查删除信号强度变异系数大
              采用苏木精-伊红（HE）染色法和尼氏染色法进行观                        于 30% 的信号峰，余下数据经填补缺失值、数据标准化
          察。取“2.3”项下各组小鼠经固定的脑组织，从前囟切取                         等预处理后进行统计分析，包括 Student’s t 检验和代谢
          PFC区，进行常规石蜡包埋后切片，分别经HE染色和尼                          物水平变化倍数（fold change，FC）分析等单变量统计分

          氏染色后，使用显微镜观察其神经组织病理学形态变化                            析，以及主成分分析（principal component analysis，PCA）
          并拍照记录（每个 PFC 样品选 3 个区域拍照）。采用                        和 偏 最 小 二 乘 法 - 判 别 分 析（partial  least  squares-
          Image Pro Plus软件采集尼氏染色阳性（呈蓝色的细粒状                    discriminant analysis，PLS-DA）等多元统计分析。以t检
          或斑块状）区域的光密度（optical density，OD）值，再计算                验校正 P 值＜0.05 及 PLS-DA 分析的变量重要性投影
          该 OD 值与对应区域面积的比值，即平均光密度（mean                       （variable importance in projection，VIP）值＞1 为标准筛
          optical density，MOD），用以表示尼氏小体的总量。                   选差异代谢物 。代谢物的鉴定参照其精确分子量（分
                                                                          [12]
          2.5 PFC代谢组学分析                                       子量误差＜30×10 ）及 MS/MS 模式所得碎片信息在
                                                                              －6
          2.5.1 PFC组织样品前处理                                    HMDB、Metlin、LipidMaps 等数据库中匹配注释的准确
              取“2.3”项下各组小鼠冻存的PFC组织，精密称取适                      信息。
          量，置于 2 mL EP 管中，精密加入预冷的组织提取液
                                                              2.5.4 差异代谢物及代谢通路分析
          [75% 甲醇-氯仿（9∶1，V/V）+25% 水]1 mL，加入 3 颗钢
                                                                  将筛选出的差异代谢物导入 MetaboAnalyst 5.0 在
          珠，使用研磨仪（频率 50 Hz）冷冻研磨 60 s×2 次；于室
                                                              线平台的“pathway analysis”模块进行通路分析。该分
          温下超声 30 min 后，于冰上静置 30 min；于 4 ℃下以
                                                              析模块基于京都基因和基因组数据库（Kyoto Encyclope‐
          12 000 r/min离心10 min，取上清液850 μL至2 mL离心
                                                              dia of Genes and Genomes，KEGG），采用超几何检验数
          管中，真空下浓缩至尽干；干燥物用含50%乙腈的4 mg/L
                                                              据分析算法和相对中介中心性拓扑结构进行代谢通路
          的 2-氯苯丙氨酸溶液 100 μL 复溶，经 0.22 μm 滤膜过
                                                              分析。通路分析结果中，P 值＜0.05 的通路被认定为存
          滤，取滤液，备测。
                                                              在显著改变的代谢通路。
          2.5.2 UPLC-MS/MS分析及数据采集
                                                              2.6 数据统计与分析
              取“2.5.1”项下各组小鼠 PFC 组织样品溶液，进行
                                                                  采用GraphPad Prism 9软件进行数据统计分析和图
          UPLC-MS/MS 分析。色谱柱为 ACQUITY UPLC  HSS
                                                     ®
                                                              表绘制。实验数据均以x±s表示，采用t检验进行比较。
          T3（2.1 mm×150 mm，1.8 μm）；流动相为0.1%甲酸溶液
                                                              检验水准α＝0.05。
         （A）-0.1% 甲酸乙腈溶液（B）（正离子模式）或 5 mmol/L
                                                              3 结果
          甲酸铵溶液（C）-乙腈（D）（负离子模式），进行梯度洗脱
                                                              3.1 行为学测试结果
         （0～1 min，98%A 或 98%C；1～9 min，98%A→50%A 或
                                                                  Y 迷宫实验结果显示，与对照组比较，氯胺酮组小
          98%C→50%C；9～12 min，50%A→2%A 或 50%C→2%C；
          12～13.5 min，2%A 或 2%C；13.5～14 min，2%A→98%A          鼠的交替率显著降低（P＜0.05）。NOR 实验结果显示，
          或2%C→98%C；14～17 min，98%A或98%C）；自动进样                 T1实验中，两组小鼠对2个物体的探索时间比较差异均
          器温度为 8 ℃；流速为 0.25 mL/min；柱温为 40 ℃；进样                无统计学意义（P＞0.05）；T2实验中，对照组小鼠对新物
          量为 2 μL。采用电喷雾离子源进行正、负离子扫描；喷                         体 C 的探索时间显著长于其对熟悉物体 A 的探索时间
          雾电压为3.50 kV（正离子模式）、2.50 kV（负离子模式）；                 （P＜0.05），而氯胺酮组小鼠对新物体C和熟悉物体A的
          鞘气压力为 30 arb，辅助气压力为 10 arb；毛细管温度为                   探索时间比较差异无统计学意义（P＞0.05）；此外，与对
          325 ℃；全扫描分辨率为 60 000，扫描范围为 m/z 81～                  照组比较，氯胺酮组小鼠的 DI 显著降低（P＜0.01）。这

          1 000；碰撞电压为30 eV；同时，采用动态排除法去除无                      提示氯胺酮可导致小鼠认知行为缺陷。结果见表1。
          必要的MS/MS信号。                                               表1 两组小鼠的行为学测试结果（x±s）
          2.5.3 数据的预处理及分析                                          Y迷宫实验的交替率             NOR实验（n＝7）
                                                              组别               T1实验探索时间/s      T2实验探索时间/s
              收集样品质谱信息后，采用 ProteoWizard 3.0.8789                     （n＝10）/%  物体A   物体B    物体A   物体C    DI/%
                                                                                                      b
          软件将其格式转换为“mzXML”，然后使用 R 3.3.2 软件                    对照组    55.44±10.45  6.75±1.27  7.83±2.56  5.51±1.26  10.12±3.02 60.23±8.37
                                                              氯胺酮组   38.92±5.77 a  6.92±3.13  6.37±1.59  6.82±2.59  5.86±1.44 45.00±8.59 c
          的“XCMS”程序包进行峰识别、峰过滤、峰对齐及归一
                                                                 a：与对照组比较，P＜0.05；b：与同组熟悉物体A比较，P＜0.05；c：
          化处理，获得包括 m/z、保留时间、峰面积在内的数据矩                         与对照组比较，P＜0.01。

          · 1438 ·    China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 12                            中国药房  2025年第36卷第12期
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