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1.3 实验动物                                            2.3 小鼠背部皮肤损伤情况观察
              本研究所用动物为 SPF 级 BALB/c 雄性小鼠，共 60                     末次激发24 h后，肉眼观察各组小鼠背部皮肤损伤
          只，体重约 20 g，7 周龄，购自北京华阜康生物科技股份                       情况并拍照记录，然后对皮肤损伤部位进行评分，具体
          有限公司，动物生产许可证号为 SCXK（京）2019-0008。                    评分标准 见表2。
                                                                      [13]
          小鼠分笼给予标准饲料适应性室温喂养1周，自由饮水                                         表2 皮肤损伤评分标准
          进食。本动物实验方案经过贵州中医药大学动物伦理                             评分/分  红斑             水肿/丘疹       表皮脱落/抓痕
          委员会审批（伦理号为20220121）。                                0     无              无           无
                                                              1     粉色红斑无痂皮        隐约高出皮面      少许浅表皮脱落
          2 方法
                                                              2     粉红色红斑伴轻微痂皮     轻微高出皮面      许多浅表皮或部分深表皮脱落
          2.1 马齿苋乳膏的制备                                        3     暗红色红斑伴轻微痂皮     较明显高出皮面     大量深表皮脱落
              将马齿苋药材粉碎，加入 8 倍量纯水，90 ℃提取 2                     4     暗红色红斑伴重度痂皮     显著高出皮面      大量深层表皮成片状脱落
          h，过滤，药液用旋转蒸发仪浓缩至 1 g/mL（以生药量                        2.4 样本采集
          计），备用。参考文献[9]方法制备马齿苋乳膏，具体原                              末次给药2 h 后，各组小鼠吸入乙醚气体麻醉，眼球
          料/用量见表1。具体制备方法：称量油相原料置于95 ℃                         取血后颈椎脱臼处死小鼠。血样静置 1 h 后，于 4 ℃条
          水浴锅中加热融化，另称量水相原料置于 95 ℃水浴锅                          件下以3 000 r/min离心20 min，取上清液置于－80 ℃冰
          中加热，然后用玻璃棒边搅拌边将水相加入油相中，并                            箱冻存备用。取小鼠背部皮肤，刮去多余脂肪，将皮肤
          加入促渗剂、防腐剂，即可得到马齿苋提取液含量为                             切成 0.5 cm 大小的圆片，置于－80 ℃冰箱冻存备用。
                                                                        2
                         [10]
          10%、20% 的乳膏 。空白基质乳膏不加入马齿苋提取                         取完背部皮肤后，取出小鼠背部皮肤下肌肉软骨中的脊
          液，其余同法制作而得。
                                                              髓，在体式显微镜下，逐个摘取背根神经节（dorsal root
                  表1 马齿苋乳膏制备原料和用量表
                                                              ganglia，DRG），置于－80 ℃冰箱冻存备用。
           组成        原料                          用量           2.5 小鼠皮肤组织病理学变化观察
           油相        鲸蜡硬脂醇橄榄油酸酯和山梨坦橄榄油酸酯         7%
                     单甘酯                         4%               取“2.4”项下皮肤组织适量，于 4% 多聚甲醛中固
                     辛酸/癸酸甘油三酯                   4%           定，经梯度乙醇脱水、石蜡包埋、切片、脱蜡后，进行苏木
                     角鲨烷                         2%
                     聚二甲基硅氧烷                     1%           素-伊红（HE）染色，采用显微镜观察小鼠皮肤组织病理
                     十八醇                         1%           学形态变化。
           水相        甘油                          4%           2.6 小鼠血清中TNF-α、IgE水平检测
                     汉生胶                         0.1%
                     4D-透明质酸                     0.2%             取“2.4”项下血清样品（每组随机选择6只小鼠），按
                     水                           加至100%       照ELISA试剂盒说明书进行检测，采用酶标仪在450 nm
                     马齿苋提取液                      10%或20%
           促渗剂       氮酮                          0.8%         波长处检测吸光度，并根据标准曲线计算样品中TNF-α、
                     四氢胡椒碱                       0.8%         IgE水平。
           防腐剂       苯氧乙醇                        0.6%
                                                              2.7 小鼠DRG中MrgprA3、MrgprD、MrgprC11 mRNA
          2.2 造模、分组与给药
                                                              表达水平检测
              将小鼠随机分成空白组、模型组、糠酸莫米松乳膏
                                                                  采用 qRT-PCR 法检测。取“2.4”项下 DRG 适量（每
          组（阳性对照）、空白基质乳膏组和马齿苋低、高浓度乳
                                                              组随机选择 3 只小鼠），加入 Trizol 试剂研磨成浆，提取
          膏组（马齿苋提取液含量为 10%、20%），每组 10 只。小
                                                              总 RNA，然后将 RNA 逆转录成 cDNA，以 cDNA 为模板
          鼠适应性喂养1周后，于实验前一天用剃毛器剃去颈背
                                                              进行 PCR。反应条件为：95 ℃预变性；95 ℃变性 15 s，
          部约为2 cm×3 cm的毛发，依据文献[11]方法建立ACD
                                                              60 ℃退火延伸60 s，循环40次。采用2           －ΔΔCt 法，以β-actin
          模型：实验开始第1天，除空白组外，其他各组小鼠用25
                                                              为内参基因计算目的基因表达水平。各基因引物由武
          μL 7% DNCB溶液[以丙酮-橄榄油溶液（4∶1，V/V）配制]
                                                              汉华研生物科技有限公司合成，引物序列及扩增产物长
          涂抹于小鼠背部剃毛处以致敏，第2天重复同样操作，第
          5 天 以 同 样 方 法 在 小 鼠 背 部 剃 毛 处 涂 抹 20  μL  1%        度见表3。
          DNCB 溶液进一步激发，第 8、11 天重复第 5 天操作；空                    2.8 小鼠皮肤组织中 Occludin、Claudin-1 蛋白表达水
          白组小鼠同法涂抹等量不含 DNCB 的丙酮-橄榄油溶                          平检测
                                           [12]
          液。根据中药外用药理实验技术规范 ，各给药组及空                                采用Western blot法检测。取“2.4”项下皮肤组织适
          白基质乳膏组小鼠从实验第1天开始涂抹相应药物或空                            量（每组随机选择 3 只小鼠），剪碎，加入 RIPA 裂解液低
          白基质，模型组和空白组小鼠涂抹等量生理盐水，每天1                           温研磨，于 4 ℃条件下以 12 000 r/min 离心 15 min，吸取
          次，每次约0.5 g，连续14 d。                                  上清液进行蛋白定量。蛋白变性处理后，进行十二烷基


          · 1354 ·    China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 11                            中国药房  2025年第36卷第11期
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