Page 45 - 《中国药房》2025年8期

2.3.3 细胞活力检测 对表达量，具体操作同“2.3.2”项。采用 Western blot 法
采用 CCK-8 法检测。取对数生长期细胞，按 5 000 检测 PTEN 蛋白的表达，具体操作如下：收集各组细胞，
个/孔接种于 6 孔板中，按“2.3.2”项下方法分组、处理。 以RIPA裂解液裂解后，离心收集总蛋白；总蛋白以BCA
分别于培养 0、24、48 h 时，按“2.3.1”项下方法检测并计 法测定浓度后，进行变性处理。取变性蛋白适量，进行
算各组细胞活力。 SDS-PAGE 分离并以湿转法转移至聚偏二氟乙烯膜上，
2.3.4 细胞凋亡检测 以5%脱脂牛奶封闭1 h；洗膜后，加入PTEN、GAPDH一
采用流式细胞术检测。取对数生长期细胞，按 2× 抗（稀释比例分别为 1∶2 000、1∶2 500），4 ℃孵育过夜；
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10 个/孔接种于 6 孔板中，按“2.3.2”项下方法分组、处 洗膜后，加入相应二抗（稀释比例 1∶5 000），室温孵育
理。培养48 h后，收集细胞，用PBS洗涤3次后重悬，加 1 h；洗膜后，以 ECL 试剂显影后成像，以目的蛋白与内
入Annexin Ⅴ/FITC试剂5 μL，吹打混匀，室温避光孵育
参（GAPDH）的灰度值比值表示目的蛋白的相对表
30 min；加入碘化丙啶（PI）溶液 5 μL，室温避光孵育 5
达量。
min；用PBS洗涤后，使用流式细胞仪检测各组细胞的凋
2.4 统计学方法
亡情况。
采用SPSS 20软件对数据进行统计分析。实验数据
2.3.5 细胞迁移和侵袭能力检测
以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步
采用Transwell实验检测。取对数生长期细胞，以不
两两比较采用Tukey事后检验。检验水准α＝0.05。
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含血清的培养基重悬，制成2×10 个/mL的单细胞悬液。
取上述悬液 0.1 mL，接种于不包被基质胶（检测细胞迁 3 结果
3.1 裸鼠成瘤实验结果
移能力）或包被基质胶（检测细胞侵袭能力）的Transwell
与模型对照组比较，异鼠李素低、高剂量组裸鼠的
小室上层；取含20%胎牛血清的培养基，置于小室下层。
上室细胞按“2.3.2”项下方法分组、处理。培养 48 h 后， 瘤体体积及质量均显著降低（P＜0.05），且异鼠李素高
收集细胞，用 PBS 洗涤后置于 4% 多聚甲醛溶液中在室 剂量组显著低于异鼠李素低剂量组（P＜0.05）。结果见
温下固定 15 min；用 PBS 洗涤，以 0.1% 结晶紫染色液在 图1、表2。
室温下染色 2 h；用 PBS 洗涤，以棉签擦去未迁移的细
模型对照组
胞，使用光学显微镜观察各组细胞迁移和侵袭情况（迁
移或侵袭细胞呈紫色）并拍照、计数。 异鼠李素低剂量组
2.3.6 细胞中miR-212-3p、PTEN表达检测
异鼠李素高剂量组
（1）miR-212-3p 与 SLC25A25-AS1、PTEN 靶向关系
验证：利用ENCORI在线数据库（https：//rnasysu.com/en‐
cori）预测 miR-212-3p 与 SLC25A25-AS1、PTEN 的潜在
图1 各组移植瘤裸鼠瘤体观察图
结合位点。采用双萤光素酶报告基因实验进行靶向关
表2 各组移植瘤裸鼠的瘤体体积及质量比较（x±s，
系验证：构建含结合位点的野生型质粒载体（SLC25A2
n＝5）
5-AS1-WT和PTEN-WT）以及含突变结合位点的突变型
组别 瘤体体积/mm 3 瘤体质量/g
质粒载体（SLC25A25-AS1-MUT 和 PTEN-MUT）。将上
模型对照组 1 195.02±231.72 0.89±0.18
述野生型质粒载体和突变型质粒载体分别和 miR-212- 异鼠李素低剂量组 819.53±127.66 a 0.61±0.09 a
3p mimics 或 mimics NC 共转染至 MKN28 细胞中，得 异鼠李素高剂量组 389.19±163.99 ab 0.30±0.11 ab
SLC25A25-AS1-WT+mimics NC 组、SLC25A25-AS1-WT+ a：与模型对照组比较，P＜0.05；b：与异鼠李素低剂量组比较，P＜
0.05。
miR-212-3p mimics 组 、SLC25A25-AS1-MUT+mimics NC
3.2 MKN28细胞实验结果
组、SLC25A25-AS1-MUT+miR-212-3p mimics组、PTEN-
WT+mimics NC 组 、PTEN-WT+miR-212-3p mimics 组 、 3.2.1 异鼠李素干预浓度筛选结果
PTEN-MUT+mimics NC 组 和 PTEN-MUT+miR-212-3p 与 0 μmol/L 异鼠李素组[（99.19±0.68）%]比较，5
mimics组，每组设置3个复孔。培养24 h后，收集细胞， μmol/L异鼠李素组细胞活力[（95.35±0.97）%]差异无统
按照双萤光素酶报告基因检测试剂盒说明书方法使用 计学意义（P＞0.05），而 10、20、40、80、160 μmol/L 异鼠
酶标仪检测萤光素酶活性。 李 素 组 细 胞 活 力 [（88.78±1.05）% 、（85.67±1.11）% 、
（2）miR-212-3p、PTEN mRNA 及蛋白表达检测：取 （62.48±1.14）% 、（51.35±0.88）% 、（18.97±1.07）% ] 均
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对数生长期细胞，按 2×10 个/孔接种于 6 孔板中，按 显著降低（P＜0.05）；异鼠李素抑制胃癌细胞的IC50值为
“2.3.2”项下方法分组、处理。培养48 h后，收集细胞，采 67.11 μmol/L，遂以 70 μmol/L 作为后续实验的干预
用 RT-qPCR 法检测其中 miR-212-3p、PTEN mRNA 的相 浓度。

中国药房 2025年第36卷第8期 China Pharmacy 2025 Vol. 36 No. 8 · 935 ·