Page 44 - 《中国药房》2025年8期
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碧云天生物技术有限公司；RNAiso Plus提取试剂、逆转                      个复孔。继续培养 24 h，弃去培养基，各孔加入 CCK-8
          录 试 剂 盒 、实 时 荧 光 定 量 PCR（real-time  fluorogenic     试剂10 μL，于37 ℃下孵育1 h后，使用酶标仪于450 nm
          quantitative PCR，RT-qPCR）试剂盒（批号分别为 9108、            波长下检测其吸光度值并计算细胞活力[细胞活力
          RR092A、CN830S）均购自日本 Takara 公司；兔抗 PTEN              （%）＝（实验孔吸光度值－空白孔吸光度值）/（对照孔吸
          单克隆抗体、兔抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）多克                        光度值－空白孔吸光度值）×100%]，同时计算异鼠李素
          隆抗体（批号分别为 ab170941、ab9485）均购自英国 Ab‐                 的半数抑制浓度（IC50 ）。
          cam公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔免疫球蛋白                           2.3.2 细胞分组、处理及转染效果评价
          G二抗（批号SA00001-2）购自武汉三鹰生物技术有限公                           将 MKN28 细胞分为对照组、异鼠李素组、异鼠李
          司；双萤光素酶报告基因检测试剂盒（批号 E2920）购自                        素+敲减阴性对照组、异鼠李素+敲减 SLC25A25-AS1
          美国 Promega 公司；敲减 SLC25A25-AS1 及其阴性对照                组、异鼠李素+过表达阴性对照组、异鼠李素+过表达
          慢病毒、过表达 SLC25A25-AS1 及其阴性对照慢病毒、                     SLC25A25-AS1 组，每组设置 3 个复孔。除对照组加入
          miR-212-3p 模拟物（miR-212-3p mimics）及其阴性对照             等体积 DMSO 外，其余各组细胞均加入 70 μmol/L 的异
         （mimics NC）、SLC25A25-AS1 野生型（SLC25A25-AS1-           鼠李素（浓度参考“2.3.1”项下IC50值设置）；异鼠李素+敲
          WT）及突变型（SLC25A25-AS1-MUT）质粒、PTEN 野生                 减阴性对照组、异鼠李素+敲减SLC25A25-AS1组、异鼠
          型（PTEN-WT）及突变型（PTEN-MUT）质粒均由苏州吉                     李 素 + 过 表 达 阴 性 对 照 组 和 异 鼠 李 素 + 过 表 达
          玛基因股份有限公司提供或合成；RT-qPCR实验所用引                         SLC25A25-AS1组则在加入异鼠李素前通过慢病毒转染
          物均由生工生物工程（上海）股份有限公司设计并合成。                           建立稳定的敲减阴性对照、敲减SLC25A25-AS1、过表达
          1.3 动物与细胞                                           阴性对照和过表达 SLC25A25-AS1 细胞。具体转染步
              本研究所用动物为 15 只 SPF 级雄性 BALB/c 裸鼠，                骤如下：取对数生长期的细胞接种于6孔板中，待其汇合
          体重 21～25 g，购自辽宁长生生物技术股份有限公司，                        度达 50% 时分别加入敲减阴性对照、敲减 SLC25A25-
          生产许可证号为 SCXK（辽）2020-0001。所有裸鼠均饲                     AS1、过表达对照和过表达SLC25A25-AS1慢病毒（感染
          养于中国医科大学实验动物中心（温度18～22 ℃，相对                         复数为40，病毒滴度约为8×10 TU），继续培养24 h后，
                                                                                         6
          湿度50%～60%，每12 h明暗交替）。本研究方案通过牡
                                                              更换新鲜培养基；继续培养，待细胞汇合度达 80% 时用
          丹江医学院实验动物福利伦理委员会批准（编号 2023-                         嘌呤霉素（1 μg/mL）筛选稳定转染的细胞，并通过 RT-
          MYG2R01）。                                           qPCR实验检测其SLC25A25-AS1的表达情况来判断转
              本研究所用细胞为人胃癌细胞 MKN28（批号 FT-                      染是否成功。
          Y1357），购自上海梵态生物科技有限公司。
                                                                  RT-qPCR 实验的具体操作如下：取上述各组细胞，
          2 方法                                                弃去培养基，以磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤后，以 RNAiso
          2.1 细胞培养                                            Plus提取试剂提取总RNA，按相应试剂盒说明书方法将
              将MKN28细胞接种于含10%胎牛血清和1%青-链                       其逆转录为 cDNA，并以此为模板进行 qPCR 扩增。反
          霉素双抗的RPMI-1640培养基中，于37 ℃、5%CO2条件                    应体系为 TB Green Premix Ex Taq Ⅱ Fast qPCR 试剂
          下培养。
                                                              12.5 μL，正向、反向引物（引物序列及产物大小见表 1）
          2.2 裸鼠成瘤实验
                                                              各1 μL，cDNA模板1 μL，灭菌水9.5 μL。反应条件为：
              裸鼠适应性饲养 1 周后，于左侧腋下注射 1×10 个
                                                       7
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          MKN28细胞（用生理盐水重悬）以构建移植瘤模型。待
                                                              40 个循环。分别以 GAPDH（mRNA 检测）或 U6（miR检
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          瘤体生长至 100 mm 时，将裸鼠随机分为模型对照组和                                        －ΔΔCt
                                                              测）为内参，采用 2         法计算目的基因的相对表达量，
          异鼠李素低、高剂量组，每组5只。异鼠李素低、高剂量
                                                              结果以对照组为参照进行归一化处理。
          组裸鼠分别腹腔注射 20、40 mg/kg 异鼠李素[给药方法
                                                                          表1 引物序列和产物大小
                                 [15]
          及注射剂量参考相关文献 ，以二甲基亚砜（DMSO）为
                                                              目的基因            引物序列（5’→3’）            产物大小/bp
          溶剂]，模型对照组裸鼠腹腔注射等体积 DMSO，每天 1                        SLC25A25-AS1    正向：CCTGGATGTATGCCTCAC   199
          次，连续15 d。末次给药后，将裸鼠安乐死，取其瘤体并                                         反向：GGAGAATCGCTTGAACCT
                                                              PTEN            正向：CTATTCTAACACCTCACCATTG  264
          测定瘤体体积和质量。
                                                                              反向：CTCATTCAGACCTTCACATTC
          2.3 MKN28细胞实验                                       GAPDH           正向：TATGACAACAGCCTCAAGAT  104
          2.3.1 异鼠李素处理浓度的确定                                                   反向：AGTCCTTCCACGATACCA
                                                              miR-212-3p      正向：GCGCGTAACAGTCTCCAGTC  65
              将 MKN28 细胞接种于 96 孔板中，培养过夜待贴壁
                                                                              反向：AGTGCAGGGTCCGAGGTATT
          后，加入0（对照）、5、10、20、40、80、160 μmol/L的异鼠李              U6              正向：CGCTTCGGCAGCACATAT   100
          素，并设置不含细胞、不含药物的空白孔，每浓度设置 3                                          反向：AAATATGGAACGCTTCACGA
          · 934 ·    China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 8                               中国药房  2025年第36卷第8期
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