Page 60 - 《中国药房》2025年7期
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华拓生物科技公司；SP（批号BKJ4126）购自上海帛科生                       PBS清洗，再以binding buffer重悬、离心，调整细胞密度
                                                                     6
          物技术有限公司。                                            至 1×10 个/mL。 向 细 胞 悬 液 中 依 次 加 入 Annexin
          2 方法                                                Ⅴ-FITC 溶液、PI 溶液，混匀，避光孵育 15 min。使用流
          2.1 细胞培养、分组与给药                                      式细胞仪检测，并采用 FlowJo 软件分析凋亡数据（流式
              将HPAEpiC细胞接种于含10%胎牛血清、100 U/mL                  图中，左上象限为坏死细胞，右上/下象限为凋亡细胞，左
          青 霉 素 、100  μg/mL 的 DMEM 培 养 基 中 ，于 37  ℃ 、         下象限为正常活细胞，凋亡率为右上/下象限凋亡细胞数
          5%CO2条件下培养（每2 d更换1次培养基），至对数生长                       占细胞总数的比例）。

          期后进行后续实验。                                           2.5 细胞中增殖/凋亡、通路相关蛋白表达检测
              取对数生长期的 HPAEpiC 细胞，随机分为对照组                          用 Western blot 法检测。取对数生长期的 HPAEpiC
         （Control组），SP组，PEI低、中、高浓度组（P-L、P-M、P-H               细胞，按“2.1”项下方法分组、处理。24 h后，以裂解液提

          组），PEI 高浓度+Akt 通路激活剂组（P-H+SC79 组），每                 取各组细胞的总蛋白，再以 BCA 法测定蛋白含量。将
          组设置 6 个复孔。除 Control 组（正常培养，不经任何处                    蛋白与缓冲液混合，于水浴中加热 5 min 变性。取变性
                                                        [7]
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          理）外，SP组细胞用1×10  cfu/mL的SP菌液处理24 h ，                 蛋白适量，进行电泳分离并转膜，以脱脂奶粉封闭 1 h；
          PEI 各浓度组细胞分别用 0.05、0.10、0.20 mmol/L 的 PEI           洗膜后，加入增殖/凋亡相关蛋白（CDK1、Bax）、通路
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         （浓度根据前期 MTT 实验确定）+1×10  cfu/mL 的 SP 菌                相关蛋白（Rac1、p-Akt、Akt、p-NF-κB、NF-κB）、内参蛋
          液共同处理 24 h，P-H+SC79 组细胞用 0.20 mmol/L 的              白（β-actin）一抗（稀释比例分别为 1∶1 000、1∶1 000、
          PEI+10 μmol/L 的 SC79 +1×10  cfu/mL 的 SP 菌液共同        1∶2 000、1∶2 000、1∶2 000、1∶2 000、1∶2 000、1∶2 000），
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                              [8]
          处理24 h。                                             于4 ℃下孵育过夜；洗膜后，加入相应二抗（稀释比例为
          2.2 细胞上清液中炎症因子检测                                    1∶2 000），室温下孵育 2 h；洗膜后，以 ECL 显色、成像。
              采用 ELISA 法检测。取对数生长期的 HPAEpiC 细                  使用Image J软件，以β-actin为内参蛋白，分析各目的蛋
          胞，按“2.1”项下方法分组、处理。24 h后，收集各组细胞                      白的表达水平，以 p-Akt 与 Akt、p-NF-κB 与 NF-κB 蛋白
          培养液，离心，取上清液，按照相应试剂盒说明书方法操                           的表达水平比值表示Akt、NF-κB蛋白的磷酸化水平。
          作，使用酶标仪检测细胞上清液中 IL-6、IL-8、IL-1β                     2.6 统计学方法
          水平。                                                     采用SPSS 25.0软件对数据进行统计分析。实验数
          2.3 细胞氧化应激指标检测                                      据均以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，进
              采用比色法检测细胞上清液中SOD、LDH含量。取                        一步两两比较采用SNK-q检验。检验水准α＝0.05。
          对数生长期的HPAEpiC细胞，按“2.1”项下方法分组、处                      3 结果
          理。24 h 后，收集各组细胞培养液，离心，取上清液，按
                                                              3.1 PEI 对 SP 诱导的 HPAEpiC 细胞上清液中炎症因
          照相应试剂盒说明书方法操作，使用酶标仪检测细胞上
                                                              子的影响
          清液中SOD、LDH含量。
                                                                  与 Control 组比较，SP 组细胞上清液中 IL-6、IL-8、
              采用 2′，7′-二氯荧光素二乙酸酯（2′，7′-dichloro‐
                                                              IL-1β 水平均显著升高（P＜0.05）；与 SP 组比较，P-L、P-
          fluorescin diacetate，DCFH-DA）荧光探针法检测细胞中
                                                              M、P-H 组细胞上清液中 IL-6、IL-8、IL-1β 水平均显著降
          ROS 含量。取对数生长期的 HPAEpiC 细胞，按“2.1”方
                                                              低，且呈浓度依赖性（P＜0.05）；与 P-H 组比较，P-H+
          法分组、处理。24 h 后，收集各组细胞，用胰酶消化，加
                                                              SC79组细胞上清液中IL-6、IL-8、IL-1β水平均显著升高
          入 DMEM 培养基终止消化并制备细胞悬液（细胞密度
                                                             （P＜0.05）。结果见表1。
          1×10 个/mL）；取上述细胞悬液，离心；收集细胞，用磷
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                                                              表1 各组细胞上清液中炎症因子比较（x±s，n＝6，
          酸盐缓冲液（PBS）清洗，加入DCFH-DA探针，于室温下                            pg/mL）
          避光孵育 30 min，离心；收集细胞，用 PBS 清洗 2 次后重                  组别               IL-6        IL-8       IL-1β
          悬，使用显微镜观察各组细胞的荧光变化情况并使用                             Control组       4.95±0.51   0.96±0.09   4.14±0.45
                                                              SP组            53.68±5.59 a  38.16±3.95 a  76.98±7.75 a
          Image J 软件分析其荧光强度，用以表示细胞中 ROS
                                                              P-L组           43.72±4.76 b  30.52±3.13 b  65.34±6.61 b
          含量。                                                 P-M组           29.38±3.05 bc  20.46±2.31 bc  45.94±4.78 bc
          2.4 细胞凋亡检测                                          P-H组           18.73±1.91 bcd  14.23±1.57 bcd  33.62±3.47 bcd
                                                              P-H+SC79组      35.42±3.37 e  25.08±2.63 e  52.95±5.38 e
              采用双染法检测。取对数生长期的HPAEpiC细胞，
                                                                 a：与Control组比较，P＜0.05；b：与SP组比较，P＜0.05；c：与P-L组
          按“2.1”项下方法分组、处理。24 h后，收集各组细胞，用                      比较，P＜0.05；d：与P-M组比较，P＜0.05；e：与P-H组比较，P＜0.05。


          · 822 ·    China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 7                               中国药房  2025年第36卷第7期
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