Page 55 - 《中国药房》2025年7期
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定其随机血糖，若连续 3 次所测随机血糖均不低于 16.7                      以GAPDH内参，采用2        －ΔΔCt 法计算各目的mRNA的表达
                                         [11]
          mmol/L，则表明糖尿病模型复制成功 。继续按上述条                        水平，结果以正常组为参照进行归一化处理。
          件喂养各组大鼠 1 周，留取其 24 h 尿液，若造模组大鼠                             表1 PCR扩增引物序列及产物长度
          24 h 尿蛋白定量（24 h-urinary total protein，24 h-UTP）水    目的基因      引物序列（5′→3′）                 扩增产物长度/bp
                                          [11]
          平≥20 mg，即表明 DN 模型复制成功 。造模过程中，                       p53       正向：GGAGGATTCACAGTCGGATATG      291
                                                                        反向：TGAGAAGGGACGGAAGATGAC
          造模组有4只大鼠死亡，将造模成功的24只大鼠分为模
                                                              ULK1      正向：GCTTCTTTCTGGACAAGCAACG      278
          型组、缬沙坦组、TWM 组，每组 8 只。药物灌胃量按每                                  反向：TCAGGCATAGACGCCACTCA
                                  [12]
          千克体重剂量折算系数换算 ：缬沙坦成人（体重60 kg）                        Beclin-1  正向：AATGTCTTCAATGCGACCTTCC      229
          日剂量为 80 mg，折算得缬沙坦组大鼠灌胃剂量为 8.33                                反向：CTGTCAGGGACTCCAGATACGA
                                                              miR-214   正向：ACACTCCAGCTGGGACAGCAGGCACAGAC    65
          mg/（kg·d）；TWM 成人（体重 60 kg）日剂量为 60 mg，折                        反向：TGGTGTCGTGGAGTCG
          算得 TWM 组大鼠灌胃剂量为 6.25 mg/（kg·d）；均以生                  LC3       正向：TTGGTCAAGATCATCCGGCG        175
          理盐水作为溶剂。正常组和模型组大鼠灌胃等体积生                                       反向：AGCCGAAGGTTTCTTGGGAG
                                                              GAPDH     正向：CTGGAGAAACCTGCCAAGTATG      138
          理盐水。每天1次，连续6周。
                                                                        反向：GGTGGAAGAATGGGAGTTGCT
          2.2 标本采集与生化指标检测
                                                             2.5 统计学方法
              末次给药后，各组大鼠均禁食不禁水 24 h，使用代
                                                                 使用SPSS 23.0软件对数据进行统计分析。数据以
          谢笼收集其24 h尿液，以全自动蛋白分析仪检测肾功能
                                                             x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两
          指标（24 h-UTP）水平。随后，大鼠以 2% 戊巴比妥钠麻
                                                             两比较采用 LSD-t 检验（方差齐）或 Dunnett’s T3 检验
          醉，于腹主动脉取血，取上层血清，使用全自动生化分析
                                                            （方差不齐）。检验水准α＝0.05。
          仪检测肝肾功能指标（BUN、SCr、ALB、ALT）、血脂指标
         （TG、TC）、血糖指标[空腹血糖（fasting blood glucose，            3 结果
                                                             3.1 TWM对DN大鼠肝肾功能指标的影响
          FBG）]水平。取血后，大鼠以颈椎脱臼法处死，剥离肾
                                                                 与正常组比较，模型组和各药物组大鼠体内 24 h-
          脏，切取部分置于 4% 多聚甲醛溶液中固定，余下部分
                                                             UTP、BUN、SCr、ALT水平均显著升高，ALB水平显著降
          于－80 ℃下冻存，待检。
                                                             低（P＜0.01）；与模型组比较，缬沙坦组、TWM组大鼠体
          2.3 肾组织病理学改变观察
                                                             内 24 h-UTP、BUN、SCr、ALT 水平均显著降低，ALB 水
              取“2.2”项下各组大鼠固定的肾组织适量，经修剪、
                                                             平均显著升高（P＜0.01）。结果见表2。
          脱水、石蜡包埋后切片（厚约4 μm），进行苏木精-伊红染
          色后，使用光学显微镜观察肾组织病理学改变。                                    表2 各组大鼠肝肾功能指标比较（x±s）
          2.4  肾 组 织 中 p53/miR-214/ULK1 轴 相 关 蛋 白 及           组别     n  24 h-UTP/mg  BUN/（mmol/L） SCr/（μmmol/L） ALB/（g/L）  ALT/（U/L）
                                                              正常组    6  13.12±2.33  8.17±1.47  22.68±1.32  28.28±0.84  32.87±1.84
          mRNA表达检测
                                                              模型组    8  43.00±6.55 a  22.26±2.32 a  51.45±5.14 a  21.44±1.37 a  83.84±8.57 a
              采用Western blot法检测相关蛋白的表达。取“2.2”                 缬沙坦组   8  23.70±2.70 ab  16.59±1.11 ab  35.54±3.39 ab  24.10±2.24 ab  49.51±2.80 ab
          项下各组大鼠冻存的肾组织适量，加入裂解液研磨，于                            TWM组   8  23.88±5.60 ab  16.75±2.44 ab  36.75±2.44 ab  24.13±1.08 ab  54.88±7.07 ab
          冰上裂解 30 min，在 4 ℃下以 12 000 r/min 离心 10 min，           a：与正常组比较，P＜0.01；b：与模型组比较，P＜0.01。
          取上层总蛋白溶液，经变性、电泳分离、转膜、封闭后，加                         3.2 TWM对DN大鼠血糖、血脂指标的影响
          入p53、ULK1、Beclin-1、LC3、β-actin一抗（稀释比分别为                与正常组比较，模型组和各药物组大鼠体内 TG、
          1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶3 000），于 4 ℃下    TC、FBG 水平均显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，缬
          孵育过夜；加入相应二抗（稀释比例为1∶3 000），于温室                      沙坦组、TWM 组大鼠体内上述指标水平均显著降低
          下孵育 2 h；以化学发光试剂显影、曝光后成像。使用                        （P＜0.01）。结果见表3。
                  TM
          AIWBwell 软件，以 β-actin 为内参，计算各目的蛋白的                   表3 各组大鼠血脂、血糖指标比较（x±s，，mmol/L）
          表达水平。                                               组别          n       TG        TC        FBG
                                                              正常组         6     0.63±0.09  1.12±0.28  9.56±1.43
              采用实时荧光PCR（real-time PCR，RT-PCR）法检测
                                                              模型组         8     2.32±0.72 a  3.14±0.89 a  34.53±2.77 a
          相关mRNA的表达。取“2.2”项下各组大鼠冻存的肾组                         缬沙坦组        8     1.41±0.47 ab  2.13±0.42 ab  26.00±4.35 ab
          织适量，充分研磨后，在 4 ℃下以 12 000 r/min 离心 10                TWM组        8     1.50±0.73 ab  1.95±0.26 ab  27.79±2.44 ab
          min，提取总 RNA；测定其浓度、纯度后，进行转录，得                          a：与正常组比较，P＜0.01；b：与模型组比较，P＜0.01。
          cDNA；以此cDNA为模板，进行PCR扩增。PCR体系包                      3.3 TWM对DN大鼠肾组织病理学改变的影响
          括 cDNA 模板 2.0 μL，SYBR Green qPCR 预混液（2×）               正常组大鼠肾组织内肾小球分布均匀，肾小管上皮
          7.5 μL，正、反向引物（具体序列及产物长度见表 1）各                      细胞圆润，未见明显的淋巴细胞浸润；与正常组比较，模
          0.75 μL，无酶无菌水 4.0 μL。扩增条件为 95 ℃预变性                 型组大鼠肾组织内肾小管上皮呈明显的水肿状态，细胞
          30 s；95 ℃变性 15 s，60 ℃退火延伸 30 s，共 40 个循环。           肿胀，细胞质呈空泡化质，可见结缔组织增生，并伴有淋


          中国药房  2025年第36卷第7期                                                 China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 7    · 817 ·
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