Page 54 - 《中国药房》2025年6期
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2 方法                                                度。病理学评分＝（隐窝破坏程度评分+炎症细胞浸润
          2.1 造模、分组与给药                                        累及范围评分+病变范围评分）/3。
              按照 SPF 标准适应性喂养大鼠 1 周后，将其随机分                            表2 大鼠结肠组织的病理学评分标准
          为正常组（12 只）和模型制备组（30 只）。正常组大鼠每                       分值         隐窝破坏程度       炎症细胞浸润累及范围/%    病变范围
                                                              0          完整无破坏              0          无
          天自由饮水，模型制备组大鼠则饮用 5%DSS 溶液 。1
                                                     [8]
                                                              1         1/3基底部隐窝破坏         1～25       黏膜层
          周后，随机挑选正常组和模型制备组各3只大鼠处死，若                           2         2/3基底部隐窝破坏        26～50        肌层
          模型制备组大鼠结肠组织可见溃疡、黏膜糜烂、炎症细                            3         仅表面上皮完整           51～75       浆膜层
                                                              4        全部隐窝和上皮破坏          76～100       全层
          胞浸润、腺体减少或消失等病理改变，而正常组大鼠结
                                                              2.5 大鼠粪便中SCFA含量测定
          肠组织结构基本正常，则提示UC模型复制成功。
              造模结束后，将模型制备组剩余的27只大鼠随机分                             取“2.2”项下各组大鼠的粪便样品 0.2 g，置于 1.5
          为模型组、阳性对照组、复方芩柏颗粒组，每组9只。正                           mL 离心管中，用水 500 μL 匀浆 1 min 后，再以 3 000
          常组（该组剩余的9只）和模型组大鼠灌胃生理盐水，各                           r/min离心10 min；取上清液200 μL，分别加入15%磷酸
          药物组大鼠每天行2次灌胃相应药液，灌胃总体积均为                            溶液100 μL、375 μg/mL的内标溶液（以乙醇为溶剂）20
          20 mL/（kg·d），连续3周。根据成年UC患者急性活动期                     μL、乙醚280 μL，匀浆1 min，再于4 ℃下以12 000 r/min
          美沙拉秦肠溶片的剂量（3 g/d），按《动物实验方法学》                   [9]  离心 10 min，取乙醚层，即得供试品溶液。取上述供试
          的方法换算，得阳性对照组大鼠灌胃的等效总剂量为                             品溶液，采用 GC-MS 技术以内标法检测其中乙酸、丙
          270 mg/（kg·d）；根据前期动物实验结果，复方芩柏颗粒                     酸、丁酸的含量。GC-MS 条件如下：色谱柱为 Restek
          的最佳有效总剂量为 2.52 g/（kg·d） ，本研究继续使用                    Rxi-5MS 毛细管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）；进样口
                                         [10]
          该剂量。给药过程中，各组大鼠均自由饮水、摄食。                             温度为 270 ℃；载气为氦气，流速为 1.0 mL/min；顶空
          2.2 大鼠疾病活动性指数评分与取样                                  进样，进样量为 1 μL；程序升温，45 ℃保持 1 min，以
              开始灌胃后，每天记录大鼠的体重变化、粪便性状                          20 ℃/min 升至250 ℃并保持2 min。离子源为电子轰击
          及带血状况，并在末次给药完成后进行疾病活动性指数                            离子源，电子轰击能量为 70 eV；离子源温度为 220 ℃；
                                                [11]
         （disease activity index，DAI）评分（具体标准 见表 1），           检测器温度为 250 ℃；检测电压为 1 450 V；质谱信息采
          以评估大鼠肠道疾病的严重程度。DAI评分＝（体重下                           集频率为每秒 20 次，扫描范围为 m/z 38～550。以待测
          降评分+粪便性状评分+血便评分）/3。                                 成分与内标的峰面积比值为纵坐标（y）、待测成分质量
                         表1 DAI评分标准                           浓度为横坐标（x）绘制的乙酸、丙酸、丁酸回归方程分别

           分值        体重下降/%        粪便性状           血便          为 y＝0.015 8x+0.001 2、y＝0.010 8x+0.001 5、y＝0.030 2x+
           0          ＜1            正常            正常          0.010 8（R ＞0.999），三者检测质量浓度的线性范围分别
                                                                       2
           1          1～5          偏软但成形        隐血实验阳性        为 1～100、1～100、0.5～50 mg/L。该法精密度、重复性
           2          6～10          半稀便           血便
           3          ＞10           稀便           大量血便         等方法学考察均符合2020年版《中国药典》（四部）的相
              DAI 评分后，以腹部按摩法收集各组大鼠粪便，备                        关要求。
          测；随后，予大鼠禁食、不禁水24 h，将其固定，腹腔注射                        2.6 大鼠结肠组织中 GPR41、GPR43、GPR109A 蛋白
          2%戊巴比妥使其深度麻醉，剖开胸腔并暴露心脏，将针                           表达检测
          头刺入心室，取血样适量，于－80 ℃下保存，备测；取血                             采用Western blot法检测。取“2.2”项下冻存的各组
          后，以颈椎脱臼法将其处死，剖开腹腔，取结肠组织，一                           大鼠的结肠组织适量，用 RIPA 裂解液于冰上裂解，于
          部分以4%多聚甲醛溶液固定，另一部分冻存，备测。                            4 ℃下以 12 000 r/min 离心 4 min，取上清液，以 BCA 法
          2.3 大鼠血清炎症因子检测                                      检测总蛋白含量后，煮沸 5 min 使变性。取变性蛋白适
              取“2.2”项下各组大鼠血样适量，于 4 ℃下以 3 000                  量，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并
          r/min 离心 20 min，取上层血清，按相应试剂盒说明书操                    转移到聚偏二氟乙烯膜上，于室温下以 5% 脱脂牛奶封
          作，采用 ELISA 法以酶标仪检测其血清促炎因子（TNF-                      闭 1 h；洗膜 2 min，加入 GPR41、GPR43、GPR109A、
          α、IL-6）和抑炎因子（TGF-β1、IL-10）水平。                       β-actin一抗（稀释比例分别为1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、
          2.4 大鼠结肠组织病理变化观察                                    1∶20 000），于 4 ℃下孵育过夜；洗膜 10 min×3 次，加入
              取“2.2”项下各组大鼠固定24 h的结肠组织，制作石                     相应二抗（稀释比例为1∶1 000），于室温下孵育1 h；洗膜
          蜡切片；取切片，经脱水、脱蜡、HE染色、封片后，使用显                         后，以发光试剂显色，并于凝胶成像系统下成像。以
          微镜观测大鼠结肠组织的病理改变并进行病理学评分                             β-actin 为内参，计算各目的蛋白的相对表达量（即目的
                   [12]
         （具体标准 见表 2），以评估其结肠组织的病理损伤程                           蛋白与内参蛋白的条带灰度值比值）。

          · 688 ·    China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 6                               中国药房  2025年第36卷第6期
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