Page 36 - 《中国药房》2025年6期
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          1.3 实验细胞与动物                                         混合成质控样品 。每隔 6 个样品插入 1 个质控样品进
              人源肝癌细胞株 HepG2 购自中国科学院上海生命                       行分析，使用 LC-MS/MS 系统进样检测，组间差异利用
          科学研究院细胞资源中心。                                        正交偏最小二乘判别法分析。以|Fold Change 值|≥2，
              SPF级7周龄C57BL/6小鼠，24只，雄性，体重（20±                  P＜0.1 为筛选条件，分析各组之间的差异脂质代谢物。

          2）g，购于珠海百试通生物科技有限公司，生产许可证号                          以|变量重要性投影（variable importance projection，VIP）
          为 SCXK（粤）2022-0051。所有小鼠饲养于深圳华腾生                     值|＞1为筛选条件，评估脂质代谢物不同组别的贡献程
          物医药科技有限公司，使用许可证号为SYXK（粤）2023-                       度，取排名前15位的脂质代谢物进行分析。
          0327。饲养环境为SPF屏障环境，温度为（22±1）℃，12                     2.6 小鼠肝组织中PPARα蛋白表达检测
          h 光照与 12 h 黑暗交替循环。饲养过程中，小鼠自由摄                           取各组小鼠肝组织适量，加入研磨珠和裂解液充分
          入食物和水。本研究实验方案获得了深圳华腾生物医                             匀浆后，于 4 ℃、12 000 r/min 离心 15 min，取上清液，进
          药有限公司实验动物伦理委员会批准（批准编号为                              行BCA蛋白定量、变性；选取蛋白样本进行电泳、转膜，
          B202404-4）。                                         常温下封闭 1.5 h，加入 PPARα、GAPDH 抗体（稀释比例
          2 方法                                                均为1∶1 000）孵育过夜；加入二抗（稀释比例为1∶8 000），
          2.1 动物分组、给药与造模                                      于室温孵育 1 h 后，用 TBST 洗膜 3 次，滴加显色液后应
              将小鼠随机分为3组，每组8只：正常（NFD）组小鼠                       用化学发光图像分析系统显影。采用Image J软件分析
          给予SPF级常规维持饲料饲养；模型（HFD）组和HYP组                        蛋白条带的灰度值，以目的蛋白与内参蛋白（GAPDH）

          小 鼠 给 予 SPF 级 HF60 高 脂 饲 料 饲 养 16 周 以 复 制           的灰度值比值表示目的蛋白的表达水平，结果以NFD组
          NAFLD 模型。其中，HYP 组小鼠从造模第 1 天开始每                      为参照进行归一化处理。
          天早上灌胃100 mg/kg HYP（溶剂为0.5%羧甲基纤维素                    2.7 金丝桃苷介导PPARα调控脂质合成的机制验证
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          钠溶液） ，NFD组和HFD组小鼠灌胃等体积溶剂，连续                         2.7.1 细胞培养
          16周；所有小鼠自由饮食。                                           将HepG2细胞接种于含10%胎牛血清、1%青霉素-
          2.2 样本收集与处理                                         链霉素双抗的DMEM培养基中，于37 ℃、5%CO2的条件
              末次给药后，小鼠禁食不禁水16 h，然后记录体重，                       下培养。
          麻醉并摘眼球取血，于 4 ℃、3 000 r/min 离心 15 min，取              2.7.2 HYP干预浓度筛选
          血清，用于后续检测。小鼠取血后通过颈椎脱臼处死，                                采用 CCK-8 法检测细胞活力。取 HepG2 细胞，以
          分离肝脏，称定肝脏质量，并用于后续检测。                                5 000个/孔接种到96孔板中，用0、10、100、1 000 μmol/L
          2.3 小鼠肝脏病理形态学及脂质堆积观察                                的HYP干预，并设置含细胞、不含药物的阴性对照组，不
              取各组小鼠肝脏，经脱水、石蜡包埋后切片，进行苏                         含细胞和药物的空白对照组。处理24 h后，每孔加入不
          木精-伊红（HE）染色，观察其病理形态学变化；经 OCT                        含血清的 DMEM 培养基 180 μL 和 CCK-8 试剂 20 μL，
          包埋剂包埋后冷冻切片，进行油红 O 染色，观察其脂质                          于37 ℃下避光孵育2 h，使用酶标仪在450 nm波长下检
          堆积情况。                                               测每孔的吸光度（A）值，并按下式计算细胞活力：细胞活
          2.4 小鼠生化指标检测                                        力＝（不同浓度HYP组的A值－空白对照组的A值）/（阴
              取各组小鼠肝组织适量，按相应试剂盒说明书方法                          性对照组的 A 值－空白对照组的 A 值）×100%，根据结
          检测其中TAG的含量。取各组小鼠血清适量，按相应试                           果筛选后续细胞实验HYP的干预浓度。
          剂盒说明书方法检测血清中AST、ALT、TAG的含量。                         2.7.3 细胞脂滴蓄积情况和TAG含量检测
          2.5 小鼠肝脏脂质组学分析                                          将 HepG2 细胞分为正常对照组、模型组、HYP 低浓
                                                                                                       [8]
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              每组随机选取 6 只小鼠的肝脏进行脂质组学分析。                        度（50 μmol/L）组 、HYP 高浓度（100 μmol/L）组 、HYP
          精确称取肝脏20 mg，置于1.5 mL EP管中，充分匀浆，加                    低浓度+GW6471组、HYP高浓度+GW6471组，每组3个
          入 800 μL 甲基叔丁基醚-甲醇溶液（3∶1，V/V），涡旋 30                 复孔。除正常对照组外，其他各组细胞均采用 400
          s；于－20 ℃静置 1 h 后，加入水 200 μL，涡旋 30 s；于               mmol/L的油酸和200 mmol/L的棕榈酸诱导24 h模拟肝
          4 ℃、12 000 r/min离心15 min，取上层脂质提取液，真空                脂质沉积；此外，HYP 低、高浓度组细胞分别用 50、100
          浓缩，加入异丙醇100 μL复溶，涡旋30 s；于4 ℃、12 000                 μmol/L 的 HYP 干预 24 h；HYP 低浓度+GW6471 组和
          r/min 离心 15 min，取上清液进样。每个样品提取 5 μL                  HYP 高浓度+GW6471 组细胞在使用 50、100 μmol/L 的


          · 670 ·    China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 6                               中国药房  2025年第36卷第6期
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