Page 54 - 《中国药房》2025年5期
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2.3 子鼠睾丸和附睾脏器系数计算                                   白浓度，并通过高温（95 ℃、15 min）裂解变性。取变性
              根据子鼠体重（处死前称定）和生殖系统各脏器质                          蛋白进行电泳（先在 80 V 电压下电泳约 25 min，然后在
          量计算脏器系数：脏器系数＝脏器质量（g）/体重（g）×                         120 V电压下电泳约1.5 h）分离、转膜（恒流200 mA下转
          100%。                                               膜 1～2 h），然后用 5% 脱脂牛奶常温下封闭 2 h；加入
          2.4 子鼠睾丸和附睾形态学观察                                    β-tubulin、GSK3α、p-GSK3α、PP1γ2一抗（稀释比例分别
              采用苏木精-伊红（HE）染色法观察。将 4% 多聚甲                      为 1∶50 000、1∶1 000、1∶2 000、1∶2 000），4 ℃摇床孵育
          醛固定的睾丸和附睾依次进行梯度乙醇脱水、二甲苯透                            过夜；洗膜3次，加入相应二抗（稀释比例1∶5 000），室温
          明、石蜡包埋及切片（厚度 3 μm）处理，随后进行 HE 染                      下孵育2 h；洗膜后采用ECL法染色，然后将膜放入凝胶
          色和中性树脂封片，在光学显微镜下观察各组雄性子鼠                            图像分析仪中曝光成像。采用Image J图像分析软件进
          睾丸和附睾的形态与结构。                                        行定量分析，以目的蛋白与内参蛋白（β-tubulin）条带的
          2.5 子鼠附睾组织中精子形态观察                                   灰度值比值表示目的蛋白的相对表达量。
              采用巴氏染色法观察。取雄性子鼠的左侧附睾，剪                          2.10 统计学方法
          断球状部位，将断面涂于滴有生理盐水的洁净玻片上，                                使用 GraphPad Prism 9.5 软件作图，采用 SPSS 26.0
          拉薄涂片，置于室温下空气干燥后按照试剂盒说明书方                            软件对数据进行统计学分析。实验数据均符合正态分
          法操作，在巴氏染色、封片后镜检。每个切片随机选取3                           布，均以 x±s 表示。多组间比较采用单因素方差分析，
          个不同视野进行观察，每只子鼠共观察200个精子，计算                          方差齐时组间两两比较采用LSD检验，方差不齐时组间
          各组子鼠的精子畸形率。精子畸形率＝畸形精子数/精                            两两比较采用Dunnett检验。检验水准α＝0.05。
          子总数×100%。                                           3 结果
          2.6 子鼠附睾组织中精子活力测定                                   3.1 TP对雄性子鼠生殖器官质量及脏器系数的影响
              取雄性子鼠的右侧附睾，用针刺破，置于37 ℃生理                            与对照组比较，T1～T4组子鼠的睾丸质量、附睾质
          盐水中浸泡10 min，使精子游出。将精子悬浮液在磷酸                         量，T2～T4组子鼠的精囊腺质量、精囊腺系数，T3、T4组
          盐缓冲液（PBS）中洗涤2次，然后在4 ℃下以1 000 r/min                  子鼠的附睾系数及T4组子鼠的睾丸系数均显著降低或
          离心 10 min，收集精子沉淀并重悬于含有 1% 苯甲基磺                      减小（P＜0.05）。结果见表1。
          酰氟的 80 mL RIPA 缓冲液中，超声处理（超声功率 200                   表1 各组雄性子鼠生殖器官质量及脏器系数比较（x±
          W，间断超声3次，每次10 s、间隔10 s）。随后，将精子悬                          s，n＝3）
          浮液在4 ℃下以12 000 r/min离心10 min，弃上清。取精                 分组   睾丸质量/g  睾丸系数/%  附睾质量/g  附睾系数/%  精囊腺质量/g  精囊腺系数/%
          子沉淀，加入 RIPA 裂解液[精子沉淀与裂解液配比为                         对照组 3.38±0.15  0.94±0.05  1.00±0.06  0.28±0.01  0.95±0.12  0.26±0.03
          1∶10（m/m）]，于碎冰上裂解10 min；收集裂解液，在4 ℃                  T1组  3.02±0.13 a  0.88±0.02  0.97±0.02 a  0.28±0.00  0.84±0.05  0.24±0.01
                                                              T2组  2.95±0.22 a  0.88±0.07  0.89±0.02 a  0.26±0.00  0.70±0.05 a  0.21±0.17 a
          下以12 000 r/min离心10 min，收集上清液。取20 μL上
                                                              T3组  2.80±0.04 a  0.91±0.01  0.79±0.00 a  0.26±0.00 a  0.65±0.02 a  0.21±0.00 a
          清液涂于载玻片上，盖上盖玻片，用计算机辅助精子分                            T4组  2.35±0.09 a  0.83±0.03 a  0.68±0.03 a  0.24±0.01 a  0.52±0.06 a  0.18±0.02 a
          析系统检测精子活力。精子活力参数包括精子浓度、精                               注：T2、T3组附睾系数分别按平均值0.264 8%、0.256 5%进行统计
          子前向运动率（progressive motility rate，PR）、精子非前           学分析，表中展示的是取2位小数后的约值，其与对照组附睾系数比较
          向运动率（non-progressive motility rate，NP）、精子活动         的P值分别为0.082、0.010。a：与对照组比较，P＜0.05。
          力（用 PR+NP 表示）、精子平均路径速度（average path                 3.2 TP对雄性子鼠睾丸、附睾组织形态学的影响
          velocity，VAP）、精 子 直 线 速 度（straight-line  velocity，      与对照组比较，T1～T4 组子鼠的睾丸生精小管上
          VSL）、精子曲线速度（curvilinear velocity，VCL）。剩余            皮细胞数量均减少，且随着 TP 暴露剂量的增大上述病
          上清液置于－80 ℃冰箱中保存，用于Western blot实验。                   理变化越明显；T1～T4 组子鼠的附睾组织内可见上皮
          2.7 子鼠附睾组织中精子数量测定                                   细胞变性坏死、细胞质溶解、精子不同程度坏死、精子数
              取“2.6”项下精子悬浮液 0.1 mL，加 PBS 稀释 10 倍              量减少、间质内伴少量炎症细胞浸润，且随着TP暴露剂
          后用细胞计数板计数悬浮液中的精子数。精子总数以                             量的增大上述病理改变有加重趋势。结果见图1、图2。
          单侧附睾组织中悬浮液精子数×10（稀释倍数）表示 。                          3.3 TP对雄性子鼠精子形态的影响
                                                      [13]
          2.8 子鼠血清中性激素水平测定                                        T1～T4 组子鼠均出现精子形态异常的情况，主要
              采用 ELISA 法检测。将子鼠血清从－80 ℃冰箱中                     表现为折叠、无钩、香蕉型、无定型、胖头、双头和双尾。
          取出，室温下解冻，用酶标仪在450 nm波长下测定血清中                        对照组和T1～T4组子鼠的畸形精子数分别为3、21、31、
          GnRH、LH、FSH、T水平，具体操作按试剂盒说明书进行。                      44、60 个，精子畸形率分别为（0.50±0.00）%、（3.50±
          2.9 子鼠精子中 GSK3α、p-GSK3α、PP1γ2 蛋白表达                  1.32）% 、（5.17±0.29）% 、（7.33±0.76）% 、（10.00±
          测定                                                  2.00）%；与对照组比较，T1～T4组子鼠畸形精子数和精
              采用 Western blot 法测定。取“2.6”项下－80 ℃保              子畸形率均显著升高（P＜0.05），且具有一定的剂量依
          存的精子上清液适量，采用 BCA 法检测上清液中总蛋                          赖性趋势。结果见图3。


          · 560 ·    China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 5                               中国药房  2025年第36卷第5期
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