Page 26 - 《中国药房》2025年5期

2.6 转录组学实验筛选 IMP 逆转乳腺癌 DOX 耐药的 表3 DEGs的GO分类注释统计结果（个）
关键靶点 DOX组与空白对照组比较 IMP+DOX组与DOX组比较
GO分类 GO注释
2.6.1 RNA测序及cDNA文库构建 所有基因 DEGs 所有基因 DEGs
生物过程 解毒 49 10 49 5
细胞接种、分组和加药同“2.4”项下。药物作用48 h
多生物过程 1 434 136 1 434 107
后，每组收集3个样本，快速冻存于液氮中，采用干冰保 细胞杀伤 35 3 35 4
存运输至北京百迈客生物科技有限公司进行 RNA 测 免疫系统过程 1 200 100 1 200 99
生物附着 509 42 509 35
序，并通过PCR富集得到cDNA文库。将转录组测序所 细胞组分或生物合成 3 007 242 3 007 280
得的“Raw Data”过滤，得到“Clean Data”，并将后者与指 生长 222 17 222 22
定的参考基因组进行序列比对，得到“Mapped Data”，然 生殖过程 819 58 819 65
生殖 822 58 822 65
后通过插入片段长度检测、随机性检验等进行cDNA文 代谢过程 5 217 367 5 217 425
库质量评估。 细胞组分 其他有机体系 13 2 13 1
2.6.2 生物信息学分析 其他有机体系组分 13 2 13 1
胞外区部分 2 167 251 2 167 133
根据转录本在各样本中的表达量进行差异表达分 胞外区 2 632 272 2 632 151
析：采用 DESeq2_EBSeq 软件筛选差异表达基因（diffe- 细胞连接点 699 64 699 57
rentially expressed genes，DEGs），筛选标准为错误发现 大分子复合物 2 793 225 2 793 262
膜封闭腔 2 671 200 2 671 265
率（false discovery rate，FDR）＜0.01且︱log2FC︱≥2[式
细胞器部分 5 178 378 5 178 454
[10]
中，FC 为差异倍数（fold change）] 。采用 R 包 cluster‐ 细胞器 8 023 535 8 023 683
Profiler对DEGs进行基因本体（gene ontology，GO）富集 细胞膜 5 981 365 5 981 377
分子功能 金属伴侣活性 4 2 4 0
分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclope‐ 抗氧化活性 43 9 43 5
dia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，通过 蛋白质标签 6 1 6 0
CytoScape 3.7.2软件将结果进行可视化展示。 电子载体活性 64 8 64 2
结构分子活性 477 56 477 25
DEGs 分析结果（图 3）显示，与空白对照组比较， 化学排斥活性 12 1 12 2
DOX 组细胞中上调基因 1 134 个，下调基因 91 个；与 转运活性 752 56 752 41
DOX组比较，IMP+DOX组细胞中上调基因641个，下调 翻译调节器活性 28 2 28 2
分子功能调节剂 772 49 772 68
基因998个。 蛋白质结合转录因子活性 340 21 340 46
Volcano plot
KEGG 通路富集分析结果显示，与空白对照组比
1 200 1 134 DEGs上调 15
998 DEGs下调 较，DOX组细胞中有500个DEGs，涉及核糖体、溶酶体、
935
900 763 10 Significant 抗原加工和呈递、吞噬体以及 p53 信号通路等 270 条信
DEGs数量/个 600 641 －log 10 FDR 5 up：1 134 号通路；与 DOX 组比较，IMP+DOX 组细胞中有 514 个
down：91
unchange：13 258
300
91 DEGs，涉 及 叉 头 框 蛋 白 O（forkhead box protein O，
FoxO）、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein
0 0
DOX组 IMP+DOX IMP组 －5 0 5 10 kinase，MAPK）以及 p53 等 271 条信号通路。选取排前
vs. 空白 组 vs. vs. 空白
对照组 DOX组 对照组 log 2 FC
A.各组DEGs数量 B. DOX组 vs. 空白对照组 20 名的信号通路绘制可视化气泡图，详见图 4。由图 4
可知，在空白对照组和DOX组、DOX组和IMP+DOX组
Volcano plot Volcano plot
15 15 DEGs 富集得到的前 20 条信号通路中，p53 信号通路为
二者共有，因此，本研究进一步对与p53信号通路相关的
10
Significant
10
－log 10 FDR 5 up：641 －log 10 FDR 5 up：935 DEGs进行可视化分析。结果发现，空白对照组和DOX
Significant
down：763
down：998
组、DOX组和IMP+DOX组之间存在共同的DEGs，分别
unchange：13 106
unchange：11 320
为COP1、CCNE1、GADD45A和GADD45B。
0 0 2.7 关键靶点的基因表达验证
－5 －4 0 4 8 －10 －5 0 5
log 2 FC log 2 FC 采用荧光定量 PCR 实验验证组成型光形态建成蛋
C. IMP+DOX组 vs. DOX组 D. IMP组 vs. 空白对照组
白 1（constitutively photomorphogenic 1，COP1）、细胞周
图3 各组间DEGs分析结果及其对应的火山图
期蛋白E1（cyclin E1，CCNE1）、生长停滞和DNA损伤诱
GO 富集分析结果表明，所有 DEGs 被注释到 60 个 导 蛋 白 45A（growth arrest and DNA damage inducible
功能类别中，包括 24 个生物过程、19 个细胞组分、17 个 protein 45A，GADD45A）、GADD45B等关键靶点的基因
分子功能，详见表 3（该表仅列出了每个功能类别的前 表达情况。其引物序列及产物长度见表 1，具体测定方
10项）。 法同“2.4”项下，数据分析方法同“2.2”项下。
· 532 · China Pharmacy 2025 Vol. 36 No. 5 中国药房 2025年第36卷第5期