Page 25 - 《中国药房》2025年5期

120 曲线法计算目的基因MDR1、MRP1的相对表达量，并以
空白对照组为参照进行归一化处理。按“2.2”项下方法
90
细胞存活率/% 60 a 进行数据分析。结果（表 2）显示，与空白对照组比较，
DOX组、IMP+DOX组细胞中MDR1、MRP1的mRNA以
30
及 IMP 组细胞中 MDR1 的 mRNA 表达均显著下调（P＜
0
空白对照 12.5 25 50 100 200 0.05）；与 DOX 组比较，IMP+DOX 组细胞中 MDR1 的
IMP/（μg/mL）
a：与空白对照比较，P＜0.05。 mRNA表达进一步下调（P＜0.05）。
图1 IMP对MCF-7/DOX细胞活力的影响（x±s，n＝6） 表1 引物序列及产物长度
由图1可知，与空白对照比较，200 μg/mL的IMP可 目的基因 正向（5′→3′） 反向（5′→3′） 产物长度/bp
MRP1 AGGACACGTCGGAACAAGTC TGACGATCAAAGCCTCCACC 168
显著降低 MCF-7/DOX 细胞存活率（P＜0.05），而 12.5～
MDR1 GCTCCTGACTATGCCAAAGC TCTTCACCTCCAGGCTCAGT 202
100 μg/mL 的 IMP 对该细胞存活率无明显影响（P＞ COP1 AGACAACTCAGTGGCAAGCA AGCTGACTGTCTGTTGAGGC 231
0.05）。因此，本研究选用100 μg/mL作为最大无毒质量 CCNE1 TGTCCTGGATGTTGACTGCC TCAGTTTTGAGCTCCCCGTC 185
GADD45A CTGGAGAGCAGAAGACCGAA CAGGGTGAAGTGGATCTGCA 209
浓度继续后续实验。
GADD45B TGAATGTGGACCCAGACAGC TCGTGACCAGGAGACAATGC 231
2.3 IMP与DOX联用对MCF-7/DOX细胞增殖的影响 GAPDH GATTTGGTCGTATTGGGCGC TTCCCGTTCTCAGCCTTGAC 169
将细胞以8 000个/孔的密度接种于96孔板中，培养
表2 各组细胞中 MDR1、MRP1 mRNA 及其蛋白表达
24 h后加药。细胞分为空白对照组、DOX不同质量浓度
水平比较（x±s，n＝6）
组、IMP（100 μg/mL）+DOX 不同质量浓度组，每组设置
MDR1 MRP1
6个复孔。根据本课题组前期研究 将DOX质量浓度设 组别 mRNA 蛋白 mRNA 蛋白
[9]
定 为 12.5、25、50、75、100 μg/mL，空 白 对 照 组 加 入 空白对照组 1.00±0.01 1.00±0.07 1.00±0.02 1.00±0.03
1.5‰DMSO。药物作用 48 h 后，采用 MTT 法测定各孔 DOX组 0.80±0.04 a 0.82±0.05 0.45±0.03 a 0.89±0.02
IMP+DOX组 0.34±0.03 ab 0.62±0.06 a 0.41±0.01 a 0.81±0.02 a
OD值，计算细胞增殖抑制率，并计算药物对细胞的半数 IMP组 0.60±0.04 a 0.74±0.07 a 1.08±0.02 0.90±0.05
抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50 ）和 a：与空白对照组比较，P＜0.05；b：与DOX组比较，P＜0.05。
耐药逆转倍数（reverse fold，RF）。细胞增殖抑制率
2.5 IMP与DOX联用对MCF-7/DOX细胞耐药相关蛋
（%）＝（空白对照组OD值－药物组OD值）/空白对照组
白表达的影响
OD 值×100%；RF＝DOX 单用组 IC50/IMP 和 DOX 联用
细胞接种、分组和加药同“2.4”项下。药物作用48 h
组IC50。结果显示，DOX不同质量浓度组、IMP+DOX不
后，提取细胞中总蛋白，采用BCA试剂盒测定总蛋白浓
同质量浓度组细胞的增殖均受到不同程度影响，且细胞
度，100 ℃下加热6 min进行蛋白变性。取10 μg蛋白样
增殖抑制率随着DOX质量浓度的升高而升高。DOX单
品经 10%SDS-PAGE 凝胶电泳（100 V 恒压）分离，电泳
独使用时，其对MCF-7/DOX细胞的IC50为81.965 μg/mL；
结束后，在90 V恒压下转至PVDF膜，采用5%牛血清白
DOX 和 IMP 联 用 时 ，其 对 细 胞 的 IC50 下 降 为 43.170
蛋白室温封闭1 h；加入MDR1（稀释比例1∶500）、MRP1
μg/mL，RF为1.90。
（稀释比例1∶1 500）、β-actin（稀释比例1∶500）一抗，4 ℃
2.4 IMP与DOX联用对MCF-7/DOX细胞耐药相关基
孵育过夜；以 PBST 漂洗，加入 HRP 标记的山羊抗兔二
因表达的影响
抗（稀释比例 1∶20 000）、山羊抗小鼠二抗（稀释比例 1∶
参考文献[9]方法，将MCF-7/DOX细胞以1×10 个/皿
5
10 000），室温孵育 1 h；以 PBST 再次漂洗，利用 ECL 发
的密度接种于直径 35 mm 的培养皿中，培养 24 h 后，随
光液显影，采用Image J软件分析各蛋白条带灰度值，并
机分为空白对照组（1‰DMSO）、DOX 组（50 μg/mL）、
以目的蛋白与内参蛋白（β-actin）条带灰度值的比值表示
IMP+DOX 组（100 μg/mL IMP+50 μg/mL DOX）和 IMP
目的蛋白的表达水平（结果以空白对照组为参照进行归
组（100 μg/mL），每组设置6个复孔。药物作用48 h后，
一化处理）。按“2.2”项下方法进行数据分析。结果（表
按照Trizol试剂盒说明书方法提取细胞中总RNA，并对
2、图 2）显示，与空白对照组比较，IMP+DOX 组细胞中
其进行纯度和质量检验。取1 μg RNA逆转录为cDNA，
并以cDNA为模板采用荧光定量PCR仪进行扩增[引物 MDR1、MRP1 蛋白及 IMP 组细胞中 MDR1 蛋白的表达
序列由本课题组自行设计，由生工生物工程（上海）股份 均显著下调（P＜0.05）。
有限公司合成，引物序列及产物长度见表1]。PCR反应 MDR1 170 kDa MRP1 190 kDa
体系（20 μL）如下：cDNA 模板 2 μL，PCR 试剂 10 μL， β-actin 43 kDa β-actin 43 kDa
Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ
正、反向引物各 1 μL，dd H2O 6 μL。扩增条件如下： A. MDR1 B. MRP1
95 ℃预变性 30 s；95 ℃变性 10 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃ Ⅰ：空白对照组；Ⅱ：DOX组；Ⅲ：IMP+DOX组；Ⅳ：IMP组。
延伸30 s，共40个循环。以GAPDH为内参，采用双标准 图2 各组细胞中MDR1、MRP1蛋白表达的电泳图

中国药房 2025年第36卷第5期 China Pharmacy 2025 Vol. 36 No. 5 · 531 ·