Page 45 - 《中国药房》2025年4期
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2.4 膝关节软骨组织病理观察                                    2.8 统计学方法
              每组随机选取6只大鼠，麻醉后处死，收集膝关节软                            使用SPSS 25.0软件进行统计分析。所有数据均以
          骨组织，用 4% 多聚甲醛溶液固定 7 d 后，将样品置于                      x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两
          20%乙二胺四乙酸（pH 7.4）中脱钙，每3 d更换一次脱钙                    比较采用事后SNK-q检验。检验水准α＝0.05。
          溶液，直到组织软化；然后将样品脱水，石蜡包埋后切片
                                                             3 结果
         （5 μm）。取部分切片分别进行苏木精-伊红（HE）、番红
                                                             3.1 棕矢车菊素对大鼠膝关节肿胀度的影响
          O-固绿染色，通过光学显微镜观察并拍照，再根据
                                                                 与假手术组比较，OA 组大鼠膝关节肿胀度显著升
                        [11]
          Mankin评分标准 对大鼠OA严重程度进行评价。
                                                             高（P＜0.05）；与 OA 组比较，棕矢车菊素组大鼠膝关节
          2.5 膝关节软骨组织中TNF-α、IL-18、IL-6水平检测
                                                             肿胀度显著降低（P＜0.05），Compound C 组大鼠膝关节
              每组取剩余的6只大鼠，麻醉后处死，收集膝关节软
                                                             肿胀度显著升高（P＜0.05）；与棕矢车菊素组比较，棕矢
          骨组织。取部分组织，根据 ELISA 试剂盒说明书操作，
          检测膝关节软骨组织中TNF-α、IL-18、IL-6水平。                      车菊素+Compound C 组大鼠膝关节肿胀度显著升高
          2.6 膝关节软骨组织中collagen Ⅱ、ACAN、ADAMTS5               （P＜0.05）。结果见表1。
          蛋白表达检测                                             表1 各组大鼠膝关节肿胀度和Mankin评分比较（x±s）
              采用免疫组化法检测。取“2.4”项下各组大鼠剩余                        组别               膝关节肿胀度（n＝12）/cm   Mankin评分（n＝6）/分
          膝关节软骨组织切片进行抗原修复，然后于100 ℃保存                          假手术组                 7.79±0.21       0.21±0.01
                                                              OA组                 10.73±0.24 a     4.43±0.20 a
          1 h，以阻断内源性过氧化物酶，再用10%牛血清白蛋白
                                                              棕矢车菊素组               8.68±0.23 b     1.39±0.12 b
          阻断后，加入collagen Ⅱ、ACAN、ADAMTS5一抗（稀释
                                                              Compound C组         11.86±0.19 b     5.69±0.18 b
          比例分别为 1∶300、1∶500、1∶900），于 4 ℃孵育过夜；次                棕矢车菊素+Compound C组    9.53±0.20 c     2.88±0.13 c
          日用磷酸盐缓冲液洗涤切片，加入二抗（稀释比例                                a：与假手术组比较，P＜0.05；b：与OA组比较，P＜0.05；c：与棕矢
          1∶1 000），于37 ℃孵育1 h；最后用二氨基联苯胺处理并                   车菊素组比较，P＜0.05。
          切 片 。 通 过 Image  J 软 件 分 析 collagen  Ⅱ 、ACAN、      3.2 棕矢车菊素对大鼠膝关节软骨组织病理的影响
          ADAMTS5蛋白表达（染色呈棕黄色）的吸光度值。                              HE染色结果（图1）显示，假手术组大鼠软骨组织形
          2.7 膝关节软骨组织中 AMPK/NLRP3 信号通路相关                     态正常；OA组大鼠软骨组织有缺损，软骨细胞分布不均
          蛋白表达检测                                             且数量减少；与OA组比较，棕矢车菊素组大鼠软骨组织
              取“2.5”项下各组大鼠剩余膝关节软骨组织，先用                       缺损、软骨细胞分布不均且数量减少的现象有所缓解，
          RIPA 缓冲液裂解并提取总蛋白，再用 BCA 法测量蛋白
                                                             Compound C 组大鼠软骨组织缺损、软骨细胞分布不均
          质浓度后，加热变性。取30 μg蛋白质进行电泳分离，将
                                                             且数量减少的现象较严重；与棕矢车菊素组比较，棕矢
          分离后的蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜上，用 5% 脱脂牛
                                                             车菊素+Compound C组大鼠软骨组织缺损、软骨细胞分
          奶封闭1 h后，将膜与p-AMPK、AMPK、NLRP3、cleaved-
                                                             布不均且数量减少的现象更严重。
          caspase-1、cleaved-IL-1β、GAPDH（稀 释 比 例 分 别 为
                                                                 番红O-固绿染色结果（图2）显示，假手术组大鼠软
          1∶3 000、1∶6 000、1∶4 000、1∶4 000、1∶4 000、1∶2 000）一
                                                             骨基质染色呈红色，且染色均匀；OA组大鼠部分软骨基
          抗于4 °C孵育过夜；次日用TBST缓冲液洗涤膜3次后，
          将膜与二抗（稀释比例 1∶4 000）于室温孵育 2 h。使用                    质染色较浅且软骨细胞数量减少；与OA组比较，棕矢车
          ECL试剂检测条带，Image J 软件分析灰度值，以目的蛋                     菊素组大鼠软骨基质染色加深且软骨细胞数量增加，
          白与内参蛋白的灰度值比值作为目的蛋白的表达水平，                           Compound C组大鼠软骨基质染色较浅且软骨细胞数量
          再以 p-AMPK 与 AMPK 的灰度值比值作为 AMPK 蛋白                  较少；与棕矢车菊素组比较，棕矢车菊素+Compound C
          的磷酸化水平。                                            组大鼠软骨基质染色更浅且软骨细胞数量更少。









                A.假手术组               B. OA组           C.棕矢车菊素组            D. Compound C组  E.棕矢车菊素+Compound C组
             黑色箭头：软骨细胞；红色箭头：软骨损伤。
                                      图1 各组大鼠膝关节软骨组织的HE染色显微图


          中国药房  2025年第36卷第4期                                                 China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 4    · 423 ·
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