Page 74 - 《中国药房》2025年3期
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min，35%B→80%B；35～40 min，80%B）；柱温为 50 ℃，             组 SK-UT-1 细胞存活率均显著降低（P＜0.05）；GAA 浓
          上样量为 200 ng，流速为 300 nL/min。分离后的馏分真                  度大于80 μmol/L时，细胞存活率均小于50%。因此，后
          空离心浓缩后，采用质谱仪进行分析，检测方式为正离                            续研究选择80、40、20 μmol/L作为GAA的干预浓度。
          子模式，母离子扫描范围为m/z 100～1 700，毛细管电压                                    150
          为 1  500  V，干 燥 气 体 速 度 为 3  L/min，干 燥 温 度 为

          180 ℃；利用 ddaPASEF 模式采集质谱数据，然后采用                                   细胞存活率/%  100  a  a  a
          DIA-NN（v1.8.1）搜库软件，以 Library-free 方法搜库，预                           50             a  a
          测谱图库，并利用该谱图库进行蛋白质分析以及质控评
                                                                              0
          价（包括肽段长度分布、肽段数分布、肽段漏切位点数分                                              Ⅰ  Ⅱ  Ⅲ  Ⅳ  Ⅴ  Ⅵ  Ⅶ
                                             [6]
          布、主成分分析等，以保证结果符合要求） ，然后将相应                             Ⅰ：对照组；Ⅱ：GAA 5 μmol/L组；Ⅲ：GAA 10 μmol/L组；Ⅳ：GAA
                                                              20 μmol/L组；Ⅴ：GAA 40 μmol/L组；Ⅵ：GAA 80 μmol/L组；Ⅶ：GAA
          数据过滤后用于后续的生物信息学分析。                                  160 μmol/L组；a：与对照组比较，P＜0.05。
          2.3 生物信息学分析                                          图1 各组细胞存活率的检测结果比较（x±s，n＝3）
              基于“2.2”项下结果，以差异倍数（fold change，FC）≥              3.2 4D-DIA蛋白组学分析和生物信息学分析结果
          1.5或FC≤0.666 7，且P值≤0.05筛选差异蛋白，并绘制                   3.2.1 蛋白质量评估结果
          差异蛋白统计柱状图；然后将每个差异蛋白的FC以2为                               肽段长度（图2A）结果显示，大部分肽段有7～20个
          底数取对数，P 值以 10 为底数取对数的绝对值，绘制火                        氨基酸，符合基于酶解和质谱碎裂方式的一般规律，质
              [8]
          山图 。另外，使用 WoLF PSORT 软件对差异蛋白进行                      谱鉴定到的肽段长度也符合质控要求。肽段数量分布
          亚细胞定位，并绘制饼图，然后对差异蛋白进行基因本                            和漏切位点数分布（图2B、2C）结果显示，肽段数量较多
          体（gene ontology，GO）分析和京都基因与基因组百科全                   且漏切位点数为0的肽段占比较高（为72.99%），符合质

          书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信    控要求（肽段数量越多，表示该蛋白越可信；肽段漏切位
          号通路分析。                                              点数为 0 的肽段越多，表示酶切越彻底，鉴定结果越可
          2.4 差异蛋白表达验证实验                                      信）。主成分分析（图2D）结果显示，各组样本之间的蛋
              为了进一步验证 GAA 在分子层面对 UF 的调控作                      白差异明显，组内样本之间相关性明显，符合质谱上机
          用，选取FC排前3名的差异蛋白进行验证。将细胞分为                           标准。
          正常组（用EEC细胞）、模型组（用SK-UT-1细胞）、阳性对                      12 500
                                                                                   1 000
                                  [9]
          照组（米非司酮，10 μmol/L ，用 SK-UT-1 细胞）和 GAA                10 000               750
          高、中、低浓度组（80、40、20 μmol/L，浓度根据“2.1”项下                 肽段数量/个  7 500  Charge  蛋白数量/个  500
                                                                               2
                                                                               3
                                                                               4
                                                               5 000
          结果设置，用SK-UT-1细胞），细胞密度为8 000个/孔，每                                          250
                                                               2 500
          组设3个复孔。培养24 h后，将细胞裂解、离心、定量后，                           0                   0
                                                                    10  15  20  25  30  1        5                    9                           13                           17                             21                           25                           29                           33                           37              ＞40
          进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，以                                     肽段长度                    肽段数量/个
                                                                   A.肽段长度分布                 B.肽段数量分布
          5%TBST 封闭液室温封闭 2 h，加入 NDRG1、ERRFI1、
                                                                                    200
          CXCL3、GAPDH蛋白一抗（稀释度均为1∶1 000）于4 ℃                   0（72.99%）             100
          条件下孵育过夜；以 TBST 洗膜，加入相应二抗（稀释度                                            PC2 （25.27%）  －100 0
          均为1∶10 000）室温孵育2 h；以TBST洗膜，经显色后，采                                2（3.21%）  －200                对照组
                                                                                                         GAA组
          用凝胶成像系统进行观察，然后以 Image J 软件进行分                                                －200     －100          0              100           200
                                                                         1（23.80%）
                                                                                             PC1（47.36%）
          析，以GAPDH蛋白为内参，计算各目的蛋白的表达水平。                         C.肽段漏切位点数分布                 D.主成分分析结果
          2.5 统计学方法                                                        图2 蛋白质量评估结果
              利用SPSS 25.0软件进行数据处理，计量资料以x±s                    3.2.2 差异蛋白分析结果

          表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比                                由图3A、3B可知，GAA组与对照组共获取了921个
          较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。                              差异蛋白，其中上调蛋白254个、下调蛋白667个。
          3 结果                                                3.2.3 差异蛋白的亚细胞定位结果
          3.1 GAA对SK-UT-1细胞增殖活性的影响                                结果显示，差异蛋白主要分布在线粒体、细胞核、细
              由图 1 可知，与对照组比较，10～160 μmol/L GAA                胞外基质、细胞质和细胞膜，具体见图4。


          · 320 ·    China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 3                               中国药房  2025年第36卷第3期
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