Page 52 - 《中国药房》2025年2期
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2.2 HF大鼠模型制备                                        用显微镜观察其肝组织病理改变并拍照。
              将60只大鼠适应性饲养1周后，随机分为正常对照                         2.8 大鼠肝组织纤维化程度观察
          组（10只）和造模组（50只）。其中，造模组大鼠使用四氯                            取“2.4”项下固定于 4% 多聚甲醛溶液中的各组大
          化碳（CCl4 ）诱导建立 HF 模型：大鼠皮下注射首剂为 5                     鼠肝组织，常规制备石蜡切片，经脱蜡复水后，依次行
          mL/kg 的 40%CCl4-橄榄油溶液，而后每隔 3 d 皮下注射                 Weigert 铁苏木精染液染核（5 min）、盐酸乙醇分化（30
                                                 [10]
          40%CCl4-橄榄油溶液（3 mL/kg）1次，连续8周 ；正常对                  s）、水冲洗（1 min）、Masson 蓝化液返蓝（1 min）、水漂洗
          照组大鼠皮下注射等体积橄榄油。8 周后，随机选取造                          （2 min）、丽春红品红染液染色（5 min）、弱酸（即水与弱
          模组大鼠 5 只和正常对照组大鼠 1 只，麻醉后取肝组织                        酸溶液以体积比 2∶1 配出的弱酸工作液，下同）清洗（1
          进行HE及Masson染色，若肝组织可见明显的纤维化病                         min）、磷钼酸溶液漂洗（1 min）、弱酸工作液漂洗（1
          变和炎症细胞浸润，则确认HF大鼠模型复制成功。                             min）、苯胺蓝染液染色（2 min）、弱酸工作液漂洗（1
          2.3 分组与给药                                           min），然后进行梯度乙醇脱水（3 次，每次 10 s）、二甲苯
              依据 2020 年版《中国药典》（一部）所载乌梅参考用                     透明后，以中性树胶封片，待封固、晾干后，使用显微镜
                                               [11]
          量、文献报道临床常用剂量及古今度量衡 ，本研究按                            观察其肝组织纤维化程度并拍照。
          成人日服乌梅30 g生药量给药，折算得到大鼠等效给药                          2.9 大鼠肝组织超微结构观察
          剂量为2.7 g/（kg·d）。                                        取“2.4”项下固定于 4% 多聚甲醛溶液中 48 h 的各
              模型建立成功后，将造模组大鼠随机分为模型组、                          组大鼠肝组织，以磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗 15 min×3
                                              [12]
          阳性对照药组[秋水仙碱，0.09 mg/（kg·d） ]和乌梅低、                   次，再于 1% 锇酸固定液中固定 2 h，以漂洗液漂洗 15
          中、高剂量组[1.35、2.70、5.40 g/（kg·d），分别为 0.5、1、2          min×3 次；于 4 ℃下行梯度乙醇脱水，再用无水丙酮室
          倍临床等效剂量]，每组9只。各给药组大鼠灌胃相应药                           温脱水20 min×3次；于室温下，将组织置于由无水丙酮
          物，灌胃体积均为 10 mL/kg；正常对照组和模型组大鼠                       和包埋液以体积比1∶1组成的混合液中包埋3 h，再在由
          灌胃等体积生理盐水；每天1次，连续8周。                                无水丙酮与包埋液以体积比1∶2组成的混合液中静置过
          2.4 体重、肝脏质量记录及取材                                    夜，最后在 37 ℃包埋液中放置 3 h；将组织依次置于
              末次给药结束后，称定各组大鼠的体重，麻醉后打                          37 ℃烘箱内过夜、45 ℃烘箱内 12 h、60 ℃烘箱内 48 h；
          开腹腔，于腹主动脉取血，血样静置后于4 ℃下以3 000                        以超薄切片机切片后，行 3% 醋酸铀-枸橼酸铅双染色，
          r/min 离心 10 min，获得上层血清，于－20 ℃下保存，备                  使用透射电镜观察其肝组织超微结构并拍照。
          用。取血后，将肝脏充分暴露，快速分离其周围组织，取                           2.10 大鼠肝细胞凋亡水平检测
          出整个肝脏，称重并记录。分别于各组大鼠肝脏相同部                                采用 TUNEL 法检测。取“2.4”项下固定于 4% 多聚
          位剪取部分肝组织，洗净，吸干，以 4% 多聚甲醛溶液固                         甲醛溶液中的各组大鼠肝组织，常规制备石蜡切片，依
          定，待后续行肝组织 HE、Masson 染色和超微结构观察；                      次在二甲苯溶液中浸泡 15 min×3 次、无水乙醇中浸泡
          剩余肝组织于－80 ℃下冻存，用于后续相关指标及蛋白                          10 min×2 次、90% 乙醇中浸泡 2 min×1 次、水中浸泡 2
          的提取与检测。                                             min×1 次，擦干；加入 20 μg/mL 不含 DNase 的蛋白酶
          2.5 大鼠肝脏指数测定                                        K，于 37 ℃下孵育后用 PBS 在摇床上清洗 3 min×3 次，
              根据大鼠体重、肝脏质量计算肝脏指数：肝脏指数                          擦干；加入 50 μL 的 TUNEL 检测液，37 ℃下避光孵育 2
         （%）＝肝脏质量（g）/体重（g）×100%。                              h，用 PBS 在摇床上洗 3 min×3 次，擦干；以抗荧光淬灭
          2.6 大鼠肝功能、肝纤维化四项及氧化应激、炎症因子                          封片剂封片，使用共聚焦显微镜观察各组大鼠肝细胞凋
          指标测定                                                亡情况并采集图像。TUNEL 染色后，正常细胞核以蓝
              使用全自动生化分析仪，分别测定各组大鼠血清中                          染为主，凋亡细胞核呈棕褐色。按下式计算细胞凋亡
          肝功能指标[丙氨酸转氨酶（alanine transaminase，ALT）、             率：细胞凋亡率（%）＝凋亡细胞数/总细胞数×100%。
          碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、天冬氨酸转氨              2.11 大鼠肝组织中TGF-β1、PDGF蛋白表达检测
          酶（aspartate transaminase，AST）及总胆红素（total biliru‐        采用Western blot法检测。取“2.4”项下各组大鼠冻
          bin，TBIL）]水平，使用酶标仪以ELISA法检测各组大鼠                     存的肝组织适量，提取总蛋白，以BCA法测定蛋白的浓
          血清中纤维化四项指标（PCⅢ、Ⅳ-C、LN、HA）水平。称                       度。将蛋白高温变性，依次进行分离胶配制、上样、电
          取“2.4”项下各组大鼠冻存的肝组织适量，按照相应试剂                         泳、转膜、洗膜、封闭等操作；分别加入TGF-β1、PDGF抗
          盒说明书要求操作，使用酶标仪检测肝组织中氧化应激                            体（稀释比例均为 1∶1 000）及内参 β-actin 抗体（稀释比
          指标（SOD、MDA、GSH-Px）、炎症因子（IL-6、TNF-α）                 例为1∶50 000），孵育过夜；洗膜后，加入相应二抗（稀释
          水平。                                                 比例为 1∶50 000），室温下摇床振摇 0.5 h，孵育 60 min；
          2.7 大鼠肝组织病理改变观察                                     洗膜后，加入 ECL 化学发光试剂进行显色，置于凝胶成
              取“2.4”项下固定于 4% 多聚甲醛溶液中 48 h 的各                  像系统成像。采用Image J软件进行灰度值检测和数据
          组大鼠肝组织，用流水冲洗；经乙醇脱水、石蜡包埋、切                           分析，以目的蛋白与内参蛋白（β-actin）的灰度值比值表
          片后，分别进行苏木精染色和伊红染色，脱水后封片，使                           示目的蛋白的表达水平。


          · 174 ·    China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 2                               中国药房  2025年第36卷第2期
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