Page 40 - 《中国药房》2025年2期
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2 方法                                                2.5 大鼠心肌组织病理损伤观察
          2.1 分组与造模                                               分别采用苏木精-伊红（HE）、Masson 染色法观察。
              随机选取 10 只健康大鼠作为对照组，其余 50 只大                     取“2.3”项下各组大鼠固定于 4% 多聚甲醛中的心肌组
                                                        [6]
          鼠采用结扎冠状动脉左前降支的方法建立 CHF 模型 ，                         织适量，经脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、烤片、脱蜡后，
          具体操作如下：用2%异氟烷麻醉大鼠，行气管插管后连                           取部分切片，加苏木精、伊红染液等进行 HE 染色；另取
          接小动物呼吸机，开胸暴露左冠状动脉并结扎左前降                             部分切片，加重铬酸钾、苏木精染液等进行 Masson 染
          支，若观察到心室壁变为苍白色且心电图监测结果示ST                           色；然后均用中性树胶封片，采用显微镜观察心肌组织
          段抬高，表明造模成功。随后，将大鼠胸腔逐层缝合，撤                           病理变化和胶原纤维化情况，并拍照。
          掉气管插管和呼吸机，术后连续给予青霉素 3 d 预防感                         2.6 大鼠心肌细胞凋亡情况检测
          染。对照组大鼠不作处理。造模过程中，共有10只大鼠                               采用TUNEL法检测。取“2.5”项下各组大鼠心肌组
          死亡，将存活且造模成功的40只大鼠随机分为模型组，                           织剩余切片，于60 ℃下烘片3 h，脱蜡后以水浸洗，滴加
          强心汤低、高剂量组，化学药组（沙库巴曲缬沙坦钠片），                          稀释好的蛋白酶 K 溶液，于室温孵育 15 min；以磷酸盐
          每组10只。                                              缓冲液清洗3次，滴加平衡缓冲液平衡15 min，吸掉多余
                                                              液 体 后 ，滴 加 工 作 液 ，经 4′，6- 二 脒 基 -2- 苯 基 吲 哚
          2.2 药液配制与分组干预
                                                             （DAPI）复染后，用中性树胶封片，采用荧光显微镜观
              强心汤含黄芪30 g、党参15 g、炮附子10 g、桂枝10 g、
                                                              察，并在400倍镜下统计细胞总数以及凋亡细胞（红色）
          川芎 10 g、丹参 10 g、葶苈子 10 g、茯苓 10 g、白术 10 g、
                                                              数，然后计算细胞凋亡率（细胞凋亡率＝凋亡细胞数/细
          柏子仁 12 g、玉竹 10 g、炙甘草 6 g。取处方量炮附子先
                                                              胞总数×100%）。
          煮1 h去除毒性，然后与其他药材共同煎煮，制成质量浓
                                                              2.7 大鼠心肌组织超微结构观察
          度分别为1.489 6、2.979 2 kg/L的强心汤药液（以生药量
                                                                  采用透射电镜观察。取“2.3”项下各组大鼠固定于
          计）。将沙库巴曲缬沙坦钠片碾碎后，溶解于水中，制成
                                                              戊二醛中的心肌组织，用 0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液漂洗
          质量浓度为1.02 g/L的药液。
                                                              15 min×3 次，再用 1% 锇酸溶液于室温下固定 2 h，于
              于造模成功第 2 天，强心汤低、高剂量组大鼠按
                                                              60 ℃下聚合 48 h 后包埋，切片（厚约 60～80 nm），再进
          12.25、24.50 g/kg 的剂量（以生药量计，其中低剂量为临
                                                              行铀铅双染色；次日，采用透射电镜观察心肌组织超微
          床等效剂量）灌胃相应药液，化学药组大鼠按10.42 mg/kg
                                                              结构，并拍照。
          的剂量（根据临床等效剂量换算而得）灌胃沙库巴曲缬                            2.8 大鼠心肌组织中 Mfn1、Mfn2、OPA1、Drp1 蛋白表
                  [7]
          沙坦药液 ，对照组和模型组大鼠灌胃生理盐水，每天 2
                                                              达检测
          次，连续28 d。
                                                                  采用Western blot法检测。随机选取“2.3”项下每组
          2.3 取材
                                                              3 只大鼠冻存的心肌组织适量，加入 RIPA 裂解液裂解
              末次给药后，以0.5%戊巴比妥钠（50 mg/kg）腹腔注
                                                              后，采用BCA法测定蛋白浓度。将蛋白样品变性后，进
          射麻醉大鼠，于腹主动脉采血，离心后取上层血清，备                            行电泳分离并转移至聚偏二氟乙烯膜上，以脱脂奶粉于
          用；继续分离其心肌组织，取每组6只大鼠的心肌组织，                           室温下封闭 2 h；洗膜后，分别加入 Mfn1、Mfn2、OPA1、
          保存于低温冰箱中，备用；另取每组1只大鼠的心肌组织                           Drp1、β-actin 一抗（稀释比例分别为 1∶5 000、1∶5 000、
          固定于戊二醛中，用于透射电镜观察；取每组剩余3只大                           1∶2 000、1∶1 000、1∶5 000），孵育过夜；洗膜后，加入相应
          鼠的心肌组织，固定于4%多聚甲醛中，用于病理观察和                           二抗（稀释比例均为1∶10 000），孵育2 h；洗膜后，以ECL
          TUNEL实验。                                            底物液显影，并于超高灵敏度化学发光成像系统下成
          2.4 大鼠血清中 NT-proBNP、ATP 和心肌组织中 PA、                  像。采用 Image J 软件分析各目的蛋白的条带灰度值，
          CL含量检测                                              以β-actin为内参，计算目的蛋白的相对表达量。
              取“2.3”项下每组6只大鼠的血清样品适量，根据试                       2.9 统计学方法
          剂盒说明书方法操作，采用 ELISA 法检测血清中 NT-                           使用SPSS 26.0软件对数据进行统计分析。实验数
          proBNP 含量，采用微量法检测血清中 ATP 含量。取                       据以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一
         “2.3”项下每组6只大鼠冻存的心肌组织适量，加入磷酸                          步两两比较采用 LSD-t 检验（方差齐）或 Tamhane’s T2
          盐缓冲液于冰浴中充分研磨后，以 3 000 r/min 离心 10                   检验（方差不齐）。检验水准α＝0.05。
          min，取上清液，根据试剂盒说明书方法操作，采用                            3 结果
          ELISA 法检测心肌组织中 CL 含量；取“2.3”项下每组 6                   3.1 强心汤对 CHF 大鼠血清中 NT-proBNP、ATP 和心
          只大鼠冻存的心肌组织适量，用丁醇-甲醇-水（5∶25∶70，                      肌组织中PA、CL含量的影响
          V/V/V）溶液抽提后，根据试剂盒说明书方法操作，采用                             与对照组比较，模型组大鼠血清中NT-proBNP含量
          ELISA法检测大鼠心肌组织中PA含量。                                显著升高，ATP 含量显著降低；心肌组织中 PA、CL 含量


          · 162 ·    China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 2                               中国药房  2025年第36卷第2期
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