Page 77 - 《中国药房》2025年1期

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进行 PCR 扩增。PCR 反应体系包括 SYBR Pre mix Ex 150 150
TM
Taq 酶（2×）10 μL、PCR 正/反向引物各 0.8 μL、cDNA 100 a 100 b
模板 2 μL 和无菌水 6.4 μL。PCR 反应条件为：95 ℃预 细胞存活率/% 50 b 细胞存活率/% 50 b b b

变性 2 min；95 ℃变性 2 s，60 ℃退火 10 s，共 40 个循环。 b
0 0
以GAPDH为内参，采用2 －ΔΔCt 法分析Nrf2、HO-1、NQO-1、 空白 25 50 100 200 400 空白 30 40 50 60 70 80
对照组 PL提取物不同质量 对照组 H 2 O 2 不同浓度组/（μmol/L）
xCT、GPX4、FTH mRNA 的表达水平，结果以 Control 浓度组/（μg/mL）
A.不同质量浓度PL提取物对细胞 B.不同浓度H 2O 2对细胞活力的影响
组为参照进行归一化处理。PCR 引物由苏州金唯智生 活力的影响（x±s，n＝5） （x±s，n＝6）
物科技有限公司设计、合成，具体序列及产物长度 150
见表1。 100 b b
表1 PCR引物序列及产物长度 细胞存活率/% 50 b b
基因 正向引物序列（5′→3′） 反向引物序列（5′→3′） 扩增产物长度/bp
GAPDH ATGACATCAAGAAGGTGGTG CATACCAGGAAATGAGCTTG 138 0
空白 25 50 100 200
Nrf2 TCTTGGAGTAAGTCGAGAAGTGT GTTGAAACTGAGCGAAAAAGGC 268 对照组 PL提取物不同质量
HO-1 AAGCCGAGAATGCTGAGTTCA GCCGTGTAGATATGGTACAAGGA 104 浓度组/（μg/mL）
NQO-1 AGGATGGGAGGTACTCGAATC AGGCGTCCTTCCTTATATGCTA 236 C.不同质量浓度PL提取物对H 2O 2诱
xCT GGCACCGTCATCGGATCAG CTCCACAGGCAGACCAGAAAA 157 导细胞活力的影响（x±s，n＝6）
GPX4 GCCTGGATAAGTACAGGGGTT CATGCAGATCGACTAGCTGAG 263 a：与对照组比较，P＜0.05；b：与对照组比较，P＜0.01。
FTH CAAGTGCGCCAGAACTACCA GCCACATCATCTCGGTCAAAA 214 图1 PL提取物毒性考察及药物干预浓度筛选结果
2.8 PL提取物对H2O2诱导的IEC-6细胞中铁死亡相关 当H2O2浓度分别为30、40、50、60、70、80 μmol/L时，
蛋白表达的影响检测 细胞的平均存活率分别为 82.68%、73.32%、59.16%、
采用Western blot法检测。按“2.5”项下方法进行细 52.04%、34.55%、20.98%。为保证细胞有足够的活力进
胞分组、造模、处理。培养 24 h 后，收集各组细胞，用 行后续实验，本研究选用60 μmol/L作为H2O2诱导浓度。
RIPA 裂解液提取总蛋白，以 BCA 法测定蛋白浓度后加 结果见图1B。
热变性。取变性蛋白适量，经 12% 十二烷基硫酸钠-聚 当PL提取物质量浓度为100、200 μg/mL时，随着药
丙烯酰胺凝胶电泳分离并转移到聚偏二氟乙烯膜上，用 物质量浓度的增加，细胞存活率呈下降趋势；当PL提取
5%脱脂牛奶封闭1 h；洗膜后，加入Nrf2、HO-1、NQO-1、 物浓度为 25、50 μg/mL 时，随着药物浓度的增加，细胞

xCT、GPX4、FTH、GAPDH一抗（稀释比例均为1∶1 000）， 存活率有所升高，提示上述质量浓度的 PL 提取物可抑
于4 ℃下孵育过夜；洗膜后，加入相应二抗（稀释比例1∶ 制 H2O2所导致的细胞存活率降低。因此，本研究选用
2 000），于室温下孵育 2 h；使用化学发光试剂显色后置 25、50 μg/mL作为后续实验PL提取物的干预质量浓度。
于凝胶成像仪下成像。以GAPDH为内参，使用Image J 结果见图1C。
软件量化 Nrf2、HO-1、NQO-1、xCT、GPX4、FTH 蛋白的 3.2 铁死亡抑制剂对 H2O2 诱导的 IEC-6 细胞活力的
表达水平，结果以Control组为参照进行归一化处理。 影响
2.9 统计学方法 当只加Fer-1时，细胞的平均存活率为98.19%，接近
采用GraphPad Prism 9软件对数据进行统计分析并 于空白对照组，提示此质量浓度的 Fer-1 对细胞几乎没
绘图。实验数据以x±s表示，多组间比较采用单因素方 有毒性；当在H2O2诱导的细胞中加入Fer-1后，细胞的存
差分析，进一步两两比较采用 LSD-t 检验。检验水准 活率较 H2O2组显著升高（P＜0.01）。由此可见，H2O2诱
α＝0.05。 导的IEC-6细胞死亡可能与铁死亡相关。结果见图2。
3 结果 150
3.1 PL提取物毒性考察及药物干预浓度筛选结果 100

当PL提取物质量浓度为200、400 μg/mL时，细胞存 细胞存活率/% a
活率（平均值分别为77.85%、36.60%）均较空白对照组显 50
著降低（P＜0.05 或 P＜0.01）；当 PL 提取物质量浓度为 0 空白 Fer-1组 H 2 O 2 组 H 2 O 2 +
对照组 Fer-1组
25、50、100 μg/mL 时 ，细 胞 存 活 率（平 均 值 分 别 为
a：与H 2O 2组比较，P＜0.01。
100.77%、104.42%、86.25%）与空白对照组比较差异均无 图2 铁抑制剂对H2O2诱导的IEC-6细胞活力的影响结
统计学意义（P＞0.05）。结果见图1A。 果（x±s，n＝6）

中国药房 2025年第36卷第1期 China Pharmacy 2025 Vol. 36 No. 1 · 67 ·