Page 76 - 《中国药房》2025年1期
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2.3 PL提取物毒性考察及药物干预浓度筛选 1 μg/μL、H2O2 60 μmol/L的完全培养基 200 μL（Fer-1 干
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2.3.1 PL提取物毒性考察 预浓度参考相关文献 设置，H2O2干预浓度参考“2.3.2”
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取对数生长期的 IEC-6 细胞，按 1×10 个/mL 接种 项下结果设置）。培养 24 h，按“2.3.1”项下 MTT 法检测
于96孔板中，每孔100 μL，培养。待细胞融合至80%左 细胞存活率，以考察H2O2导致的IEC-6细胞损伤是否与
右时，将其分为空白对照组和 PL 提取物不同质量浓度 铁死亡相关。
组，每组设置 5 个复孔。对照组加入完全培养基 200 2.5 PL提取物对H2O2诱导的IEC-6细胞氧化应激的影
μL，各药物组加入含不同质量浓度PL提取物（根据预实 响检测
验结果设置，质量浓度分别为25、50、100、200、400 μg/mL， 取对数生长期的 IEC-6 细胞，按 1×10 个/mL 接种
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以PL提取物质量计）的完全培养基200 μL。培养24 h， 于96孔板中，每孔100 μL。待细胞贴壁后，将其分为对
每孔加入0.5%MTT溶液20 μL，避光反应2 h；弃去培养 照组（Control 组）、H2O2组、H2O2+PL 25 μg/mL 组、H2O2+
基，每孔加入二甲基亚砜 150 μL，振摇 5 min，使用酶标 PL 50 μg/mL 组，每组设置 6 个复孔。Control 组加入完
仪于490 nm波长处检测各孔的吸光度值，并计算细胞存 全培养基200 μL，H2O2组加入含H2O2 60 μmol/L的完全
活率（细胞存活率＝实验组细胞的平均吸光度值/对照组 培养基 200 μL，H2O2+PL 25、50 μg/mL 组分别加入含
细胞的平均吸光度值×100%），以考察PL提取物对细胞 H2O2 60 μmol/L 和 PL 提取物 25、50 μg/mL 的完全培养
活力的影响。 基 200 μL（H2O2、PL 提取物干预浓度分别参考“2.3.2”
2.3.2 H2O2作用浓度筛选 “2.3.3”项下结果设置）。培养24 h，收集细胞上清液，按
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取对数生长期的 IEC-6 细胞，按 1×10 个/mL 接种 照相应试剂盒说明书方法操作，使用酶标仪检测其
于96孔板中，每孔100 μL，培养。待细胞融合至80%左 MDA含量和SOD活性。
右时，吸弃培养液，以磷酸盐缓冲液（PBS）清洗 1 次后， 按上述方法进行细胞分组、造模、处理。培养 24 h
TM
将其分为空白对照组和H2O2不同浓度组，每组设置6个 后，收集各组细胞，加入 ROS 试剂盒中 BODIPY 581/
复孔。对照组加入完全培养基200 μL，其余各组分别加 591C11试液（以无血清培养基稀释，终浓度为2 μmol/L）
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入含不同浓度 H2O2 （参考相关文献 设置，浓度分别为 1 mL，于 37 ℃下孵育 30 min；弃去上清液，细胞用 PBS
30、40、50、60、70、80 μmol/L）的完全培养基200 μL。培 1 mL清洗2次，加入胰蛋白酶1 mL，消化3 min后，加入
养 24 h，按“2.3.1”项下方法检测各组细胞存活率，以筛 培养基 1 mL 终止消化。收集细胞悬液，于 4 ℃下以
选H2O2的作用浓度。 10 000 r/min 离心 3 min，吸弃培养基，细胞用预冷的
2.3.3 PL提取物干预浓度筛选 PBS 1 mL清洗2次后，再以预冷的PBS 400 μL稀释，使
取对数生长期的 IEC-6 细胞，按 1×10 个/mL 接种 用流式细胞仪检测细胞内ROS水平。
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于96孔板中，每孔100 μL，培养。待细胞融合至80%左 2.6 PL提取物对H2O2诱导的IEC-6细胞线粒体膜电位
右时，吸弃培养液，以PBS清洗1次后，将其分为空白对 的影响
照组和 PL 提取物不同质量浓度组，每组设置 6 个复孔。 按“2.5”项下方法进行细胞分组、造模、处理。培养
对照组加入不含 H2O2的完全培养基 200 μL，其余各组 24 h后，收集各组细胞，加入JC-1荧光探针试液（以二甲
分别加入含 H2O2 60 μmol/L 和 PL 提取物 25、50、100、 基亚砜为溶剂，终浓度为 10 μg/mL），于 37 ℃下孵育
200 μg/mL 的完全培养基 200 μL（H2O2和 PL 提取物干 20 min；细胞用 PBS 轻柔洗涤 2 次后，再以 PBS 5 mL 稀
预浓度参考“2.3.2”“2.3.1”项下结果设置）。培养 24 h， 释，使用倒置荧光显微镜观察细胞状态（JC-1 聚合物呈
按“2.3.1”项下 MTT 法检测细胞存活率，以进一步筛选 红色荧光，JC-1单体呈绿色荧光），分析每张显微图的平
后续实验PL提取物的干预浓度。 均荧光强度并计算细胞线粒体膜电位（mitochondrial
2.4 铁死亡抑制剂对 H2O2诱导的 IEC-6 细胞活力的影 membrane potential，MMP；MMP＝红色平均荧光强度/
响检测 绿色平均荧光强度），以反映各组细胞线粒体膜的去极
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取对数生长期的 IEC-6 细胞，按 1×10 个/mL 接种 化程度（MMP与去极化程度成反比）。
于96孔板中，每孔100 μL，培养。待细胞融合至80%左 2.7 PL提取物对H2O2诱导的IEC-6细胞中铁死亡相关
右时，吸弃培养液，以PBS清洗1次，将其分为空白对照 mRNA表达的影响检测
组、Fer-1组、H2O2组、H2O2+Fer-1组，每组设置6个复孔。 采用定量 RT-PCR 法检测。按“2.5”项下方法进行
对照组加入完全培养基 200 μL，Fer-1 组加入含 Fer-1 1 细胞分组、造模、处理。培养 24 h 后，收集各组细胞，使
μg/μL 的完全培养基 200 μL，H2O2 组加入含 H2O2 60 用 Trizol 试剂提取其总 RNA，检测其浓度和纯度后，使
μmol/L的完全培养基200 μL，H2O2+Fer-1组加入含Fer-1 用反转录试剂盒将其反转录为 cDNA，然后以此为模板
· 66 · China Pharmacy 2025 Vol. 36 No. 1 中国药房 2025年第36卷第1期
