Page 32 - 《中国药房》2025年1期
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12 h暗交替、温度（22±2） ℃、相对湿度（40±5）%，饲养                   解剖大鼠，迅速取相同部位的肝脏中叶，使用生理盐水
          期间大鼠自由活动。本实验已通过首都医科大学附属                             漂洗干净，将部分组织固定于 10% 中性固定液中，另一
          北京中医医院北京市中医药研究所实验动物伦理委员                             部分组织置于－80 ℃冰箱中保存。
          会审查批准（伦理审批号为SQ-2022-02-50）。                         2.5 血清胰岛素水平、生化指标及炎症因子检测
          2 方法                                                    取血清样品，采用 ELISA 法检测血清空腹胰岛素
          2.1 药液制备                                           （fasting insulin，FINS）水平，并计算大鼠胰岛素抵抗指
              清血消脂降糖方组成：黄连30 g，虎杖、大黄、姜黄、                      数（HOMA-IR）及胰岛素敏感指数（insulin sensitivity in‐
          泽泻、茵陈、白术各 15 g，萆薢、石菖蒲各 10 g，红花 5 g。                 dex，ISI）。HOMA-IR＝FINS（mIU/L）×FBG（mmol/L）/
          取以上药材，用 10 倍量水浸泡 60 min，煎煮 1 h，趁热纱                  22.5，ISI＝1/（FBG×FINS）。由于 ISI 为非正态分布，计
          布过滤；取药渣加 8 倍量水二次煎煮 30 min，过滤，合并                     算结果取自然对数 。采用微量法检测大鼠血清中血脂
                                                                              [8]
          煎液，浓缩滤液质量浓度为 1.305 g/mL（以生药量计）。                    （TC、TG、LDL-C、HDL-C）、肝功能（ALT、AST、AKP）及
          使用研钵研磨二甲双胍片直至粉末状，计算所需给药剂                            氧化应激（MDA、SOD）指标水平；采用ELISA法检测血
          量后以0.5%羧甲基纤维素钠溶液进行溶解。                               清中炎症因子（IL-6、TNF-α、CRP）水平。
          2.2 造模、分组与给药                                        2.6 肝组织病理学观察
              SD大鼠适应性喂养1周后，采用随机数字表法将其                             取10%中性固定液固定的肝组织，经乙醇梯度脱水
          分为正常对照组（8只）和造模组（76只）。正常对照组大                         后，依次放入二甲苯中透明，再浸入石蜡中进行包埋，制
          鼠予以普通饲料饲养，造模组大鼠予以高脂高糖饲料饲
                                                              成5 μm厚切片。使用全自动染色机进行HE染色后，采
          养。连续喂养4周后，造模组大鼠隔天按30 mg/kg腹腔
                                                              用玻片扫描仪进行成像。
          注射1次STZ溶液（0.1 mol/L；以pH4.5柠檬酸钠无菌缓
                                                              2.7 肝组织中 PERK/FOXO1 信号通路相关蛋白表达
          冲溶液为溶剂，现配现用），共注射3次；正常对照组大鼠
                                                              检测
          腹腔注射等量柠檬酸钠缓冲液。以大鼠非同日检测（隔
                                                                  采用Western blot法检测。取适量置于－80 ℃保存
          天 检 测 1 次）的 3 次 空 腹 血 糖（fasting blood glucose，
                                                              的大鼠肝组织，加入RIPA裂解液进行匀浆，静置30 min
          FBG）＞11.1 mmol/L、随机血糖＞16.7 mmol/L 为 T2DM
                                                              后，在 4 ℃下以 12 000 r/min 离心 10 min，取上清，采用
                            [7]
          造模成功的判断标准 ，共有44只大鼠造模成功。根据
                                                              BCA 法检测总蛋白浓度。每组取 15 μg 总蛋白煮沸变
          体重及 FBG 结果将造模成功的大鼠随机分为模型组及
                                                              性，上样进行电泳（以恒压80 V启动，蛋白进入分离胶后
          清血消脂降糖方低、高剂量组（6.525、13.05 g/kg；根据人
                                                              调至120 V），在恒流400 mA下湿法转膜，以快速封闭液
          与大鼠体表面积换算，分别为0.5、1倍临床等效剂量）和
                                                              封闭；加入 β-actin（稀释度为 1∶2 000）、PERK（稀释度
          二甲双胍组（阳性对照，0.18 g/kg，临床等效剂量），每组
                                                              为 1∶500）以及 p-PERK、FOXO1、p-FOXO1（稀释度均
          11 只。给药组大鼠灌胃相应药物，正常对照组、模型组
                                                              为 1∶1 000）一抗，4 ℃孵育过夜；漂洗 3 次，加入对应二
          大鼠灌胃等体积生理盐水；每日1次，持续6周。实验期
                                                              抗（稀释度均为 1∶10 000），室温孵育 40 min；漂洗 3 次，
          间，正常对照组大鼠均存活，模型组大鼠因血糖持续升
                                                              应用化学发光仪进行成像，采用 Image J 软件分析蛋白
          高死亡 4 只，3 个给药组大鼠因在实验过程中操作不当
                                                              灰度值，以 p-PERK 与 PERK、p-FOXO1 与 FOXO1 的灰
          共死亡4只，每组最终均以8只大鼠进行实验。
                                                              度比值分别表示PERK、FOXO1蛋白的磷酸化水平。
          2.3 体重、FBG测定及口服葡萄糖耐量试验
                                                              2.8 统计学方法
              给药前及给药后每周末记录大鼠体重、FBG。末次
                                                                  采用 GraphPad Prism 9.5 软件进行数据分析和作
          给药后，大鼠禁食不禁水 12 h，进行口服葡萄糖耐量试
                                                              图。通过 Shapiro-Wilk 进行正态性检验，符合正态分布
          验（oral glucose tolerance test，OGTT），测量各组大鼠
          FBG（即 0 min 时血糖值），然后灌胃 50% 葡萄糖溶液（2                  的计量资料以 x±s 表示。多组间比较采用单因素方差
          g/kg），分别于糖负荷 30、60、120 min 时，采用尾尖取血                 分 析 ，组 间 两 两 比 较 采 用 SNK-q 检 验 。 检 验 水 准
          法测定大鼠血糖值，绘制OGTT曲线并计算葡萄糖曲线                           α＝0.05。
          下面积（area under the curve，AUC）。葡萄糖 AUC＝（0            3 结果
          min 血糖值+2×30 min 血糖值+3×60 min 血糖值+2×                3.1 清血消脂降糖方对T2DM大鼠体重、FBG的影响
          120 min血糖值）/4。                                          给药前，与正常对照组比较，其余各组大鼠体重均
          2.4 取材及样本处理                                         显著降低（P＜0.05），FBG 均显著升高（P＜0.05）。给药
              OGTT后第2天，大鼠禁食不禁水12 h，称重并测量                      6周后，与模型组比较，清血消脂降糖方高剂量组和二甲
          大鼠 FBG 后，处死大鼠，腹主动脉取血并以 3 000 r/min                  双胍组大鼠体重均显著升高（P＜0.05），FBG 均显著降
          离心10 min，留上清，置于－80 ℃冰箱中保存。取血后，                      低（P＜0.05）。结果见表1。


          · 26 ·    China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 1                                中国药房  2025年第36卷第1期
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