Page 54 - 《中国药房》2024年24期
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膜，在显微镜下可见左冠状动脉前降支，以6-0号结扎线                          液洗涤 1 min×10 次后，加入相应二抗（稀释比例均为
          穿入左心耳根部下方1～2 mm处，斜向右上方由肺动脉                          1∶2 000），于室温下孵育 1 h；洗膜后，以化学发光法显
          圆锥左缘出针，针距约3～4 mm，稳定3～5 min后，收紧                      色，并于凝胶成像系统下成像。以 β-actin 为内参，使用
          结扎线造成缺血（以左心室和心前壁周围心肌组织运动                            Image J 软件对 Bcl-2、p-AMPKα、MIF 蛋白的表达水平
          减弱、心电图可见宽大的畸形QRS波为缺血成功）；缺血                          进行定量分析。
          60 min后，取出结扎线，实现再灌注120 min。假手术组                     2.7 统计学方法
          小鼠只穿线不打结，其余操作相同。                                        采用 SPSS 25、GraphPad Prism 8.0 软件对数据进行
              于结扎前30 min时，I/R+PHC组、I/R+ISO-1组、I/R+            统计分析。计量资料以x±s表示，多组间比较使用方差
          PHC+ISO-1组小鼠分别单次尾静脉注射PHC（20 μg/kg）、                 分析，进一步两两比较使用 SNK-q 检验。检验水准
          ISO-1（35 mg/kg）、PHC 和 ISO-1（20 μg/kg+35 mg/kg），     α＝0.05。
          注射体积均为1 mL（注射剂量及频次参考相关文献                    [12―13]  3 结果
          设置）；假手术组和I/R组小鼠单次尾静脉注射等体积生                          3.1 PHC对小鼠心功能参数的影响
          理盐水。                                                    与假手术组比较，I/R 组小鼠的心率、每搏输出量、
          2.2 小鼠心功能指标检测                                       射血分数、心输出量、LVPWd均显著降低（P＜0.05）。与
              于再灌注120 min后，以异氟醚麻醉各组小鼠，采用                      I/R 组比较，I/R+PHC 组小鼠的心率、每搏输出量、射血
          小动物超声影像系统检测其心功能指标，包括心率、每                            分 数 、心 输 出 量 、LVPWs、LVPWd 均 显 著 升 高（P＜
          搏输出量、射血分数、心输出量、收缩期末左室后壁厚度                           0.05）；I/R+ISO-1 组小鼠的心率显著升高，而每搏输出
         （left  ventricle  posterior  wall  thickness  in  systole，  量、射血分数、LVPWs、LVPWd 均显著降低（P＜0.05）；
          LVPWs）、舒张期末左室后壁厚度（left ventricle posterior          与I/R+PHC组比较，I/R+PHC+ISO-1组小鼠的心率显著
          wall thickness in diastole，LVPWd）。                  升高，而每搏输出量、射血分数、心输出量、LVPWs、
          2.3 小鼠血清中炎症因子水平检测                                   LVPWs均显著降低（P＜0.05）。结果见表1。
              检测心功能指标后，采集各组小鼠尾静脉血适量，                              表1 各组小鼠心功能参数比较（x±s，n＝8）
          于4 ℃下以1 500 r/min离心10 min，取上层血清，根据相                            心率/   每搏输出量/  射血分数/  心输出量/  LVPWs/  LVPWd/
                                                              组别
          应 ELISA 试剂盒说明书操作，使用酶标仪检测其中 IL-                                （次/min）  μL     %   （mL/min）  mm  mm
                                                              假手术组     509.84±46.82  22.02±2.01 66.32±10.58 11.35±2.02 1.61±0.21 1.39±0.29
          6、IL-10、TNF-α水平。                                    I/R组     451.32±19.66 a  20.71±3.21 50.33±6.41 a  9.35±0.39 1.52±0.13 1.01±0.13 a
                                                                                                 a
                                                                                    a
          2.4 小鼠心肌组织病理改变观察                                    I/R+PHC组  529.93±75.86 b  25.82±2.77 78.46±10.86 13.62±2.12 1.79±0.28 1.19±0.15 b
                                                                                                 b
                                                                                           b
                                                                                                       b
                                                                                    b
                                                              I/R+ISO-1组  521.25±36.63 b  18.35±2.13 35.42±8.20 b  9.57±2.15 1.01±0.05 0.91±0.07 b
                                                                                    b
                                                                                                       b
              采用苏木精-伊红（HE）染色法观察。取血后，以颈
                                                              I/R+PHC+ISO-1组 562.18±42.69 c  19.75±3.86 54.46±10.63 11.39±1.44 1.37±0.15 0.95±0.16 c
                                                                                                       c
                                                                                           c
                                                                                                 c
                                                                                    c
          椎脱臼法处死各组小鼠，剖取心脏，取心尖缺血组织（假                              a：与假手术组比较，P＜0.05；b：与I/R组比较，P＜0.05；c：与I/R+
          手术组小鼠取左心室前壁组织，下同）适量，于 4% 多聚                         PHC组比较，P＜0.05。
          甲醛溶液中固定过夜后，行常规石蜡包埋、切片（厚约 4                          3.2 PHC对小鼠血清中炎症因子水平的影响
          μm），依次以苏木精染色5 min、伊红染色1 min，脱水后                         与假手术组比较，I/R 组小鼠血清中 IL-6、TNF-α 水
          封片，使用显微镜观察其心肌组织的病理改变。                               平均显著升高，IL-10水平显著降低（P＜0.05）。与I/R组
          2.5 小鼠心肌组织超微结构观察                                    比较，I/R+PHC组小鼠血清中IL-6、TNF-α水平均显著降
              使用 Loh 等 的方法，取各组小鼠的心尖缺血组织                       低，IL-10 水平显著升高（P＜0.05）；而 I/R+ISO-1 组小鼠
                        [16]
         （1 mm×1 mm×1 mm），采用电子显微镜进行超微结构                       血清中 IL-6、TNF-α 水平均显著升高，IL-10 水平显著降
          观察并拍摄图像。                                            低（P＜0.05）。与 I/R+PHC 组比较，I/R+PHC+ISO-1 组
          2.6 小鼠心肌组织中 Bcl-2、p-AMPKα、MIF 蛋白表达                  小鼠血清中 IL-6、TNF-α 水平均显著升高，IL-10 水平显
          检测                                                  著降低（P＜0.05）。结果见表2。
              采用Western blot法检测。取“2.4”项下各组小鼠的                 3.3 PHC对小鼠心肌组织病理形态的影响
          心尖缺血组织适量，加入RIPA缓冲液研磨后离心，提取                              假手术组小鼠心肌纤维细胞排列整齐、紧密，细胞
          总蛋白，以 BCA 法定量后作变性处理。取变性蛋白适                          质和细胞核染色均匀，无细胞坏死或炎症细胞浸润。与
          量，进行8%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离                           假手术组比较，I/R 组小鼠心肌纤维排列松散、紊乱，出
          并转移到聚偏二氟乙烯膜上，于室温下用 5% 脱脂牛奶                          血水肿明显，部分心肌纤维断裂，炎症细胞严重浸润。
          密封 3 h；加入 Bcl-2、p-AMPKα、MIF、β-actin 一抗（稀释           与I/R组比较，I/R+PHC组小鼠心肌纤维细胞排列整齐、
          比例均为 1∶1 000），于 4 ℃下孵育过夜；以 TBST 缓冲                  紧密，可见轻度水肿，出血少，细胞坏死少，炎症细胞浸


          · 3012 ·    China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 24                            中国药房  2024年第35卷第24期
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