Page 28 - 《中国药房》2024年24期
P. 28
羊抗兔IgG二抗（批号SA00003-2）购自武汉三鹰生物技 2.3 大鼠尿常规和肝肾功能检测
术有限公司；兔源 Parkin、LC3、β-肌动蛋白（β-actin）、 取“2.2”项下各组大鼠24 h尿液，送医院检验科检测
Drp1 一抗（批号分别为 GB113802、GB11124、GB15001、 24 h-UTP；取大鼠新鲜尿液 1 mL，镜下检测尿红细胞并
GB115659）和辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗 计数；取大鼠血清，送检验科检测血清肌酐（serum creati‐
（批号 GB23303）、RIPA 裂解液（批号 G2002）、BCA 蛋白 nine，Scr）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、白蛋白
定 量 检 测 试 剂 盒（ 批 号 G2026）、苏 木 精 - 伊 红 （albumin，ALB）、丙氨酸转氨酶（alanine transaminase，
（hematoxylin-eosin，HE）高清恒染试剂盒（批号G1076）、 ALT）水平。
4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色试剂（批号G1012） 2.4 大鼠肾组织病理观察
均购自武汉塞维尔生物科技有限公司。 取“2.2”项下中性多聚甲醛固定的部分大鼠肾组织，
1.3 实验动物 以乙醇脱水及二甲苯透明后，用石蜡包埋并切片，行HE
清洁级雄性SD大鼠64只，6周龄，体重180～200 g， 染色，用光镜观察肾组织病理变化。
购自河南省实验动物中心，动物生产许可证号为SCXK 2.5 大鼠肾脏系膜区IgA沉积情况观察
（豫）2022-0001。大鼠在河南中医药大学实验中心动物 取“2.2”项下中性多聚甲醛固定的部分大鼠肾组织，
房中常规饲养。本实验由河南中医药大学实验动物福 用石蜡包埋并切片，脱蜡至水，予以抗原修复、血清封闭
利 伦 理 委 员 会 审 核 批 准 ，批 准 编 号 为 IACUC- 30 min，加入IgA一抗（稀释比例1∶10），在4 ℃下孵育过
202306014。 夜；用磷酸盐缓冲液漂洗 5 min×3 次，再加入 IgA 二抗
2 方法 （稀释比例 1∶200），在室温下避光孵育 50 min；用 DAPI
2.1 大鼠建模、分组与给药 染色试剂复染细胞核，在室温下避光孵育 10 min，淬灭
64 只大鼠适应性喂养 7 d 后，随机分为正常对照组 组织自发荧光，封片，采集图像，观察肾脏系膜区IgA沉
（n＝14）和造模组（n＝50）。造模组大鼠参照文献方法 [9] 积情况，绿色荧光表示强阳性。
建立 IgAN 模型：将牛血清白蛋白用蒸馏水配制成质量 2.6 大鼠肾组织中 PINK1、Parkin、LC3、Drp1、Mfn2
浓度为100 g/L的溶液，每只大鼠按800 mg/kg隔日灌胃 mRNA表达检测
1次，连续12周；将四氯化碳与蓖麻油以1∶3的体积比混 采用实时定量PCR法检测。取“2.2”项下液氮冷冻
匀，每只大鼠皮下注射 0.4 mL，每周 1 次，连续 12 周；将 保存的各组3只大鼠的部分肾组织，测定总RNA浓度和
脂多糖用生理盐水配制成质量浓度为 0.25 g/L 的溶液， 纯度；以 RNA 单链为模板，逆转录得到 cDNA 并进行扩
每只大鼠分别于第 6、8、10 周尾静脉注射 0.2 mL。正常 增。反应条件为95 ℃预变性30 s；95 ℃变性15 s，60 ℃
对照组大鼠分别于同时段、同频次灌胃等量蒸馏水，皮 退火/延伸30 s，共40个循环。反应体系为扩增预混合溶
下注射及尾静脉注射等量生理盐水。12周末，收集各组 液 7.5 μL、无酶水 4.0 μL、正向和反向引物共 1.5 μL、
大鼠 24 h 尿液，检测 24 h 尿蛋白总量（24 h total urinary cDNA 2.0 μL。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内
protein，24 h-UTP），并从正常对照组、造模组中各随机取 参，使用 2 －ΔΔCt 法分析肾组织中 PINK1、Parkin、LC3-Ⅱ、
2只大鼠，对比观察肾脏系膜区是否有IgA沉积，有沉积 LC3-Ⅰ、Drp1、Mfn2 mRNA 表达水平，并计算 LC3-Ⅱ/
[9]
即判定造模成功 。将造模成功的大鼠随机分为模型 LC3-ⅠmRNA比值，再以正常对照组为参照进行归一化
组、醋酸泼尼松组（阳性对照，6.25 mg/kg，按照成人用药 处理。引物由武汉塞维尔生物科技有限公司提供，序列
[10]
剂量折算 ）、肾必宁等剂量组（4.1 g/kg，按照成人用药 及片段大小见表1。
[10]
剂量折算 ）、肾必宁高剂量组（20.5 g/kg，按照5倍成人 2.7 大鼠肾组织中 PINK1、Parkin、LC3、Drp1、Mfn2
用药剂量折算 ），每组 12 只。从第 13 周起，各给药组 蛋白表达检测
[10]
大鼠灌胃相应药物，正常对照组和模型组大鼠灌胃蒸馏 采用Western blot法检测。取“2.2”项下液氮冷冻保
水，每天1次，给药体积均为5 mL/kg，连续4周。 存的各组3只大鼠的部分肾组织，粉碎匀浆后提取蛋白，
2.2 样本收集 采用 BCA 法测定蛋白浓度，加热变性 5 min。取变性后
末次给药后，大鼠禁食不禁水，收集 24 h 尿液；以 的蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并转膜，加入
2%戊巴比妥钠溶液2.5 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠后，腹 PINK1、Parkin、LC3、Drp1、Mfn2、β-actin 一抗（稀释比例
主动脉取血，离心，取血清；处死大鼠，摘取双侧肾脏，部 均为1∶1 000），在4 ℃下孵育过夜；加入二抗（稀释比例
分肾脏置于 4% 中性多聚甲醛中固定；部分肾脏用液氮 为1∶3 000），在室温下孵育30 min；于化学发光成像仪中
TM
快速冷冻后，置于－80 ℃下保存。 显影，使用AIWBwell 软件分析，以目的蛋白与内参蛋
· 2986 · China Pharmacy 2024 Vol. 35 No. 24 中国药房 2024年第35卷第24期
