Page 49 - 《中国药房》2024年23期

20.74、7.78、22.60、30.15、21.42、15.00、12.53、6.95 μg/mL 220 7
200 6
的混合对照品溶液。 180 1 3 5 8 11 12 13 14 15 16 17 18 19
160 2 4 9 10 对照指纹图谱R
2.1.4 方法学考察 140 7
120
（1）精密度试验：取同一批地菍药材（编号 S16），按 U/mA 100
80
60 9
“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.1”项下色谱 40 6 10 d
20 a b c 5 混合对照品图谱
条件连续进样测定6次，以峰6（异牡荆素）为参照峰，计 0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
算得各共有峰相对保留时间及相对峰面积的 RSD 分别 t/min
为 0.02%～0.12%、1.03%～2.99%（n＝6），表明方法精密 a：没食子酸；b：原儿茶酸；c：阿魏酸；5：牡荆素；6：异牡荆素；7：鞣
度良好。 花酸；9：槲皮素；10：木犀草素；d：山柰素。
（2）稳定性试验：取同一批地菍药材（编号 S16），按 图2 对照指纹图谱R及混合对照品的叠加图谱
“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，分别于室温放置 0、 2.1.7 相似度评价
2.5、5、7.5、10、24 h时按“2.1.1”项下色谱条件进样分析， 采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012
以峰 6（异牡荆素）为参照峰，计算得各共有峰相对保留 版）》对20批地菍石油醚提取物的图谱进行相似度评价。
时 间 及 相 对 峰 面 积 的 RSD 分 别 为 0.09%～0.18%、 结果显示，20批地菍石油醚提取物图谱与对照指纹图谱
1.46%～2.98%（n＝6），表明该供试品溶液在室温放置 R之间的相似度分别为0.917、0.971、0.910、0.939、0.925、
24 h内稳定性良好。 0.927、0.973、0.837、0.644、0.990、0.905、0.943、0.941、
（3）重复性试验：取同一批地菍药材（编号 S16）6 0.930、0.771、0.975、0.945、0.603、0.904、0.873，表明不同
份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.1”项 批次地菍石油醚提取物间化学成分及含量存在差异；其
下色谱条件进样分析，以峰6（异牡荆素）为参照峰，计算 中编号S9、S15、S18的样品提取物图谱与对照指纹图谱
得各共有峰相对保留时间及相对峰面积的 RSD 分别为 R的相似度均低于0.8。进一步分析发现，这3批样品提
0.02%～0.06%、1.58%～3.26%（n＝6），表明该方法重复 取物图谱中 7 号峰（鞣花酸）峰面积均小于 6 号峰（异牡
性良好。 荆素），而其余各批次样品提取物图谱中7号峰峰面积均
2.1.5 地菍石油醚提取物HPLC指纹图谱的生成 大于6号峰，这提示鞣花酸、异牡荆素可能是影响地菍石
将 20 批地菍药材按“2.1.2”项下方法制备供试品溶 油醚提取物质量的差异物。
液，再按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。 2.2 地菍石油醚提取物对 LPS 诱导的 RAW264.7 巨噬
将图谱数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统 细胞的抗炎作用考察
（2012版）》，以样品S16的图谱为参照图谱，采用中位数 2.2.1 受试样品的制备
法，设置时间窗宽度为 0.3 min，进行多点校正后得到 精密称定地菍石油醚提取物20 mg，加入500 μL二
HPLC 叠加指纹图谱和对照指纹图谱 R。结果显示，共
甲基亚砜，配制成质量浓度为40 mg/mL的样品溶液，实
确定了19个共有峰，详见图1。
验时用DMEM培养基稀释至所需浓度。
14 15 17 18
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 16 19 2.2.2 细胞培养
1 600 R
1 500 S20
1 400 S19 将 RAW264.7 细 胞 复 苏 于 培 养 瓶 中 ，在 37 ℃ 、
S18
1 300 S17
1 200 S16 5%CO2培养箱中培养，当细胞生长密度为80%左右时进
1 100 S15
S14
1 000 S13 行传代。
900
U/mA 800 S12
S11
S10
700
600 S9 S8 2.2.3 细胞活力检测
500 S7
400 S6 取20批地菍石油醚提取物适量，分别配制成质量浓
300 S5
200 S4 S3 度为 2.5、5、10、20、40 μg/mL 的样品溶液。取对数生长
100 S2
0 S1 5
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 期的RAW264.7细胞，调整细胞密度为1×10 个/mL并接
t/min 种于96孔板中，每孔100 μL，于37 ℃、5%CO2培养箱中
图1 20批地菍石油醚提取物的HPLC叠加指纹图谱及
培养 24 h。分别设置对照组、给药组及空白组（不含细
对照指纹图谱R
胞），对照组及空白组加入 DMEM 培养基 100 μL，给药
2.1.6 共有峰的指认 组给予不同质量浓度（2.5、5、10、20、40 μg/mL，浓度根
取“2.1.3”项下混合对照品溶液，按“2.1.1”项下色谱 据前期预实验结果设置）的石油醚提取物，每组设置6个
条件进样测定，记录色谱图。将对照指纹图谱R与混合 复孔。培养 24 h 后，加入 CCK-8 溶液 10 μL，培养 2 h。
对照品溶液的图谱进行比对，共指认出5个成分，分别为 然后在450 nm波长下检测吸光度（A）值，并计算细胞存
牡荆素（5号峰）、异牡荆素（6号峰）、鞣花酸（7号峰）、槲 活率：细胞存活率＝（A 给药组－A 空白组）/（A 对照组－A 空白组）×
皮素（9号峰）、木犀草素（10号峰）。结果见图2。 100%。结果见表2。
中国药房 2024年第35卷第23期 China Pharmacy 2024 Vol. 35 No. 23 · 2879 ·