Page 48 - 《中国药房》2024年21期
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的完整性和膜在实验人员手腕背处的黏附性评价膜的                             2 mL离心管中，加入100 μL MRSA菌液（OD600＝0.4）混
          品质。                                                 匀后，加至 96 孔板中，每孔 100 μL，每组设置 3 个重复。
          2.2 LFLM中LF释放率的测定                                   将孔板置于 150 r/min、37 ℃恒温摇床上培养 24 h，吸去
              取“2.1”项下 LFLM 置于盛有 300 mL PBS 的烧杯               含药菌液，以生理盐水润洗2遍后向各孔加入100 μL甲
          中，保鲜膜封口后于150 r/min、37 ℃恒温摇床上进行释                     醇固定 10 min；弃甲醇后用生理盐水润洗 2 遍，加入
          放，分别在不同时间点取出1 mL PBS，同时补充1 mL新                      0.5% 结晶紫染色 30 min；弃染液后用生理盐水润洗 2
          的PBS。根据本课题组预实验摸索的HPLC法检测取出                          遍，加入100 μL 95%乙醇复溶后，采用酶标仪于590 nm
          的PBS中木犀草苷的含量。色谱柱为Platisil ODS；流动                    波长下测定OD值，并计算生物膜抑制率，生物膜抑制率
          相为乙腈（A）-0.1% 磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～30                     （%）＝（1－OD 给药组/OD 对照组 ）×100%。
                                                                                           +
                                                                                               2+
          min，15%A→40%A）；流 速 为 1  mL/min；进 样 量 为 10           2.6 LFLM对MRSA上清液中K 、Mg 、LDH、AKP释
          µL；检测波长为 254 nm。根据 LF 中木犀草苷的百分含                     放的影响
          量换算对应的 LF 含量，以此计算 LF 释放率，LF 释放率                         按“2.3”项下方法分组，利用 MH 肉汤培养基将
         （%）＝LF含量/LF投入量×100%。                                 LFLM和VAN调整至相应浓度，药液体积为1 mL，置于
          2.3 LFLM对MRSA菌落形成的影响                                2 mL 离心管中；将 MRSA 菌液（OD600＝0.4）稀释 100 倍
              设立 6 个组别，分别为对照组、LFLM 低浓度组（2.5                   后，取100 μL加入离心管中混匀，每组设置3个重复，置

          mg/mL）、LFLM 中浓度组（5 mg/mL）、LFLM 高浓度组                 于150 r/min、37 ℃恒温摇床上培养24 h，以10 000×g离
         （10 mg/mL）、阳性组（10 μg/mL VAN）和联合用药组（10                心 10 min；取上清液，按相应试剂盒说明书方法分别检
                                                                              2+
                                                                         +
          mg/mL LFLM+10 μg/mL VAN），上述各药物浓度根据预                 测上清液中K 、Mg 、LDH、AKP的含量。
          实验结果设置。利用MH肉汤培养基将各组药物（其中                            2.7 LFLM对MRSA中mecA、mecR1 mRNA表达水平
          LFLM 浓度以 LF 计，对照组仅含 MH 肉汤培养基）调整                     的影响
          至相应浓度，备用。利用MH肉汤培养基将MRSA菌液                               按“2.6”项下方法分组和培养 MRSA（培养时间为
          浓度调整至 OD600＝0.4[即 600 nm 波长下，菌液吸光度                  16 h），每组设置3个重复；培养结束后，离心、弃上清液，
         （OD）值为 0.4]，然后稀释 10 000 倍；向各组含药培养基                   沉淀用生理盐水清洗2遍后，收集菌体，根据试剂盒说明
          中加入十分之一体积稀释后的 MRSA 菌液，混匀，取 60                       书方法提取总 RNA，并进行逆转录和 PCR 扩增，以 16s
          μL滴加至MH琼脂平板中央，用涂布器涂布，每组设置                           rRNA为内参基因，根据2        －ΔΔt 法计算mecA、mecR1 mRNA
          3个重复，置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h观察菌落生                        的表达水平。PCR引物序列见表1。
          长情况，并计数。                                                          表1 qPCR引物序列
          2.4 LFLM对MRSA存活的影响                                  基因名称          引物序列（5′→3′）              扩增产物长度/bp
                                                              mecA          上游：GCAATCGCTAAAGAACTAAG     225
              按“2.3”项下方法分组，利用 MH 肉汤培养基将                                     下游：AATGGGACCAACATAACCTA
          LFLM和VAN调整至相应浓度，药液体积为1 mL，置于                        mecR1         上游：ACACGACTTCTTCGGTTAG      336
                                                                            下游：GTACAATTTGGGATTTCACT
          2 mL 离心管中，加入 100 μL MRSA 菌液（OD600＝0.4），             16s rRNA      上游：ACTCCTACGGGAGGCAGCAG     197
          置于150 r/min、37 ℃恒温摇床上培养6 h。培养结束后，                                 下游：ATTACCGCGGCTGCTGG
          以10 000×g离心10 min，弃上清液，向沉淀中加入1 mL                   2.8 统计学分析
          生理盐水重悬后再次离心，弃上清液后加入 1 mL 生理                             采用GraphPad Prism 8.0.1软件进行统计学分析，数
          盐水重悬，加入含 5 μmol/L 绿色荧光核酸染料 SYTO9                    据以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析中的
          和30 μmol/L碘化丙啶（pyridine iodide，PI）的染液各1.5           Tukey’s多重检验。检验水准α＝0.05。
          μL混匀，室温避光染色15 min，取10 μL滴至载玻片上。                     3 结果
          封片后于荧光显微镜下随机选取3个区域采集图像，绿                            3.1 LFLM的表征结果
          色荧光表示活菌，红色荧光表示死菌。利用 Image J 软                           LF 脂 质 体 的 粒 径 为（80.91±3.96）  nm，PDI 为
          件分别计算绿色荧光和红色荧光区域面积，以此计算死                            0.26±0.07，其粒径分布图见图 1。将 LF 脂质体与膜材
          菌与活菌之比。                                             料混合后能够顺利起膜，且具有良好的皮肤黏附性，表
          2.5 LFLM对MRSA生物膜形成的影响                               明 LFLM 制备成功。释放实验结果显示，LFLM 在 12 h
              按“2.3”项下方法分组，利用 MH 肉汤培养基将                       内释放较快，12 h内累积释放率为55%；12 h以后释放速
          LFLM和VAN调整至相应浓度，药液体积为1 mL，置于                        率减慢，36 h内的累积释放率为73%，释放曲线见图2。


          · 2618 ·    China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 21                            中国药房  2024年第35卷第21期
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