Page 41 - 《中国药房》2024年21期
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标记的羊抗兔IgG二抗（批号分别为JD59900、JD59014、                  2.2 血清性激素指标测定
          JD67265、JD58001、JD40288、JD58930、JD72933、JD54920、       末次给药结束 24 h 后，各组大鼠吸入乙醚麻醉，采
          JD59880）均购自天津俊达生物科技有限公司。                           集其尾静脉血，于4 ℃下以4 400 r/min离心14 min，取上
          1.3 实验动物                                           层血清，按相应 ELISA 试剂盒说明书方法操作，以酶标

              SPF级10周龄雌性SD大鼠，体重249～267 g，购自                  仪检测大鼠血清中E2、AMH、FSH水平。
          贵州医科大学实验动物中心，动物生产许可证号为                             2.3 卵巢组织样本采集及制备
          SCXK（贵）2023-0002。所有大鼠均分笼饲养在维持屏                         取血后，各组大鼠断头处死，开腹取出卵巢，其中左
          障环境的动物房中，温度为（24±2） ℃，相对湿度为                         侧卵巢组织存于－70 ℃备用；右侧卵巢组织置于4%多
         （55±5）%，每 12 h 明暗交替。本研究经贵阳市妇幼保                      聚甲醛溶液中固定，以不同浓度乙醇梯度脱水后浸入热
          健院科研伦理委员会批准，批准号为（2020-49）号。                        石蜡中包埋，将冷却后的石蜡组织块固定在切片机中连
          2 方法                                               续切片，得到约5 µm厚的组织薄片，备用。
                                                             2.4 卵巢组织病理改变和卵巢颗粒细胞凋亡情况观察
          2.1 造模、分组与给药
                                                                 取“2.3”项下各组大鼠卵巢组织切片，浸入二甲苯中
                                            [8]
              取64只大鼠用于构建POF大鼠模型 ：第1天，大鼠
                                                             脱蜡，以不同浓度乙醇梯度脱水后，根据相应试剂盒说
          腹腔注射环磷酰胺60 mg/kg（用生理盐水配制成质量浓
                                                             明书方法分别进行HE、TUNEL染色，使用显微镜观察。
          度为 6 mg/mL 的药液，以 10 mL/kg 体积注射）；随后，大
                                                             其中，HE 染色用于观察卵巢组织病理改变，并使用
          鼠腹腔注射环磷酰胺10 mg/kg（用生理盐水配制成质量
                                                             Image J软件计数闭锁卵泡数量（闭锁卵泡指有异常结构
          浓度为 1 mg/mL 的药液，以 10 mL/kg 体积注射），每天 1
                                                             的卵泡，如卵泡液浓缩、卵泡变性、颗粒层增厚或腔内充
          次，连续 14 d。造模期间，每天固定时间刮取大鼠阴道
                                                             满组织纤维物质）。TUNEL 染色用于观察卵巢颗粒细
          分泌物制备阴道涂片，以观察大鼠动情周期。大鼠动情
                                                             胞的凋亡情况（凋亡细胞呈黄色或棕黄色，正常细胞呈
          周期分为：动情前期（持续17～21 h，涂片上全是有核上
                                                             蓝色），并使用 Image J 软件计算卵巢颗粒细胞凋亡率。
          皮细胞，可能伴随少量角化细胞）、动情期（持续9～15 h，
                                                             卵巢颗粒细胞凋亡率（%）＝凋亡卵巢颗粒细胞数/卵巢
          涂片上全是无核角化细胞或有少量上皮细胞）、动情后
                                                             颗粒细胞总数×100%。
          期（持续 10～14 h，涂片上有核上皮细胞、角化细胞、白
                                                             2.5 卵巢组织中氧化应激指标水平检测
          细胞均可见）、动情间期（持续 60～70 h，涂片上可见大
                                                                 取“2.3”项下冻存的各组大鼠卵巢组织适量，解冻
          量白细胞及少量上皮细胞和黏膜）。若大鼠动情周期紊
                                                             后研碎匀浆，取部分匀浆于 4 ℃下以 5 600 r/min 离心
                                                       [8]
          乱或延长或长时间停留在某一时期则表示造模成功 。
                                                             15 min，取上清液，按相应 ELISA 试剂盒说明书方法操
          取造模成功的POF大鼠60只，随机分为模型组、胎盘多
                                                             作，以酶标仪检测MDA、SOD、CAT、ROS水平。
          肽低剂量组、胎盘多肽高剂量组、胎盘多肽+空载质粒
                                                             2.6 卵巢组织中凋亡和RUNX3/Notch信号通路相关蛋
          组、胎盘多肽+RUNX3沉默组，每组12只。另取12只健
                                                             白表达检测
          康大鼠作为对照组。
                                                                 采用Western blot法检测。取“2.5”项下各组剩余的
              胎盘多肽低、高剂量组大鼠分别尾静脉注射胎盘多                         卵巢组织匀浆，与RIPA裂解液混合，以BCA法测出其总
          肽注射液 1、2 mg/kg（用生理盐水配制成质量浓度分别                      蛋白浓度后煮沸变性处理。取变性蛋白适量，进行十二
          为 0.1、0.2 mg/mL 的胎盘多肽药液，以 10 mL/kg 体积注             烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并转移至聚偏二
                     [9]
          射，每天1次） ；胎盘多肽+空载质粒组大鼠尾静脉注射                         氟乙烯膜上，以 3% 牛血清白蛋白溶液在 25 ℃下封闭
          胎盘多肽注射液 2 mg/kg（用生理盐水配制成质量浓度                       2  h；洗 膜 后 ，加 入 cleaved-caspase-3、caspase-3、Bcl-2、

          为 0.2 mg/mL 的胎盘多肽药液，以 10 mL/kg 体积注射，               Bax、β-actin、RUNX3、Notch1、GAPDH一抗（稀释比例均
          每天1次）和空载质粒1 μg（剂量根据其说明书设置，每                        为 1∶750），4 ℃下孵育 12 h；洗膜后，加入相应二抗（稀
          2 d 注射 1 次）；胎盘多肽+RUNX3 沉默组大鼠尾静脉注                   释比例为 1∶3 400），25 ℃下孵育 2 h；洗膜后，经化学
          射胎盘多肽注射液 2 mg/kg（用生理盐水配制成质量浓                       发光法显色后，于凝胶成像系统下成像，采用 Image J
          度为 0.2 mg/mL 的胎盘多肽药液，以 10 mL/kg 体积注                软件定量分析各蛋白的条带灰度值，以cleaved-caspase-3、
          射，每天 1 次）和 RUNX3 siRNA 质粒 1 μg（剂量根据其               caspase-3、Bcl-2、Bax 与内参 β-actin，RUNX3、Notch1 与
          说明书设置，每2 d注射1次）；对照组、模型组大鼠尾静                        内参 GAPDH 的条带灰度值比值表示上述蛋白的表达
          脉注射生理盐水10 mL/kg。所有大鼠连续给药4周。                        水平。


          中国药房  2024年第35卷第21期                                              China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 21    · 2611 ·
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