Page 14 - 《中国药房》2024年21期

素 6（interleukin-6，IL-6）、IL-10、IL-1β、髓过氧化物酶 交互分数限定为＞0.4，绘制蛋白质-蛋白质相互作用
（myeloperoxidase，MPO）酶联免疫吸附测定试剂盒（批 （protein-protein interaction，PPI）网络，并计算各靶点的
号分别为88-7324、88-7064、88-7105、88-7013、EMMPO） degree值，以degree值排名前5位的靶点作为核心靶点。
均购自美国 Invitrogen 公司；兔源 TNF-α、蛋白激酶 B1 2.1.4 潜在靶点的功能和通路富集分析
（protein kinase B1，AKT1）、磷酸化 AKT1（p-AKT1）、信 将肉苁蓉治疗 IBD 的潜在靶点导入 DAVID 数据库
号转导和转录激活因子 3（signal transduction and activa‐ （https：//david.ncifcrf.gov）进行基因本体（gene ontology，
tor of transcription 3，STAT3）、磷酸化STAT3（p-STAT3）、 GO）、京都基因和基因组百科全书（Kyoto encyclopedia
表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor， of genes and genomes，KEGG）通路分析，并利用微生信
EGFR）、非受体酪氨酸激酶（SRC）、磷脂酰肌醇 3 激酶 在线平台（https：//www.bioinformatics.com.cn/）进行可视
（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）、磷酸化PI3K（p-PI3K） 化展示。以富集到的相应通路的靶点数和－lgP值衡量
和辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔免疫球蛋白 G 二抗 富集程度；GO 分析中选取排前 10 位的条目绘制柱状
（批号分别 GB11188、GB11689、GB150002、GB11176、 图，KEGG分析中选取排前20位的通路绘制气泡图。
GB150001、GB115662、GB112343、GB112544、GB11525、 2.1.5 分子对接
GB23303）均购自武汉赛维尔生物科技有限公司。 采 用 AutoDock Vina 软 件 对 筛 选 出 的 核 心 靶 点
1.3 主要仪器 （TNF、AKT1、STAT3、EGFR 和 SRC）与核心成分（槲皮
本研究所用主要仪器有Multiskan Go型全波长酶标 素、苏齐内酯、β-谷甾醇、肉苁蓉苷 H）进行分子对接验
仪（美国 Thermo Fisher Scientific 公司），RM2016 型病理 证。结合自由能越低，表明该核心成分与受体蛋白结合
[13]
切片机（上海徕卡仪器有限公司），Gel.Doc.XR型凝胶电 的亲和力越高 。
泳成像分析系统、Mini Trans-Blot 型蛋白印迹仪（美国 2.2 动物实验验证

Bio-Rad公司）。 2.2.1 造模、分组及给药
2 方法 雄性C57BL/6小鼠（6～7周）48只，适应性饲养1周

2.1 网络药理学分析 后按体重分为空白对照组、模型组、阳性对照组（地塞米
2.1.1 活性成分及靶点预测 松，0.4 mg/kg，剂量根据临床等效剂量换算）和 CE 低、
通过 TCMSP 平台（http：//lsp.nwu.edu.cn/）筛选肉苁 中、高剂量组（100、200、400 mg/kg，剂量参考文献[14]设
蓉活性成分（以口服利用度≥30%、类药性≥0.18为筛选 置），每组8只。空白对照组小鼠每天正常进食饮水，模
[12]
条件） ，并补充已有文献报道的具有抗IBD作用的肉苁 型组和给药组小鼠每天自由饮用 3%DSS 溶液以造模，
蓉活性成分。采用 Swiss Target Prediction 平台检索肉 自由进食。造模同时，CE 各剂量组小鼠灌胃相应剂量
苁蓉活性成分靶点（probability参数＞0），去除重复项后 的 CE（临用时以蒸馏水溶解），阳性对照组小鼠腹腔注
得 到 肉 苁 蓉 活 性 成 分 靶 点 。 以“inflammatory bowel 射地塞米松，空白对照组与模型组小鼠每天以0.01 mL/g
disease”为 检 索 词 ，分 别 从 GeneCards 数 据 库（http：// 灌胃灭菌水，每天 1 次，连续 7 d。实验期间，模型组、阳
www.genecards.org/）和 OMIM 数据库（http：//www.ncbi. 性对照组和CE低剂量组各死亡小鼠1只。末次给药后，
nlm.nih.gov/omim）收集疾病靶点，删除重复项后得到潜 禁食12 h，麻醉后摘眼球取血及结肠组织备用。
在靶点。 2.2.2 疾病活动指数计算及结肠长度检测
2.1.2 韦恩图绘制及“药物-成分-靶点-疾病”交互网络 实验期间，每天记录小鼠体重和粪便情况，参照评
[15]
构建 分标准 评价各组小鼠的体重下降、粪便性状和便血情
借助 Venny 2.1 在线分析工具将肉苁蓉活性成分靶 况，并计算疾病活动指数（disease activity index，DAI），
点与潜在靶点取交集，得到肉苁蓉治疗 IBD 的潜在靶 DAI＝（体重减轻分数+粪便性状分数+大便潜血或结肠
点。采用 Cytoscape 3.9.1 软件构建“药物-成分-疾病-靶 出血分数）/3。实验结束后，取小鼠结肠测量长度并
点”多层次网络图并进行拓扑学分析。选取度值（即 拍照。
degree 值）排前 4 位的成分作为肉苁蓉治疗 IBD 的核心 2.2.3 结肠组织病理学形态观察
成分。 取部分小鼠结肠组织以 4% 多聚甲醛固定，经石蜡
2.1.3 蛋白质-蛋白质相互作用网络绘制 包埋、切片后，进行苏木素-伊红（HE）染色。采用显微镜
将肉苁蓉治疗 IBD 的潜在靶点导入 STRING 数据 观察小鼠结肠组织病理学形态，并根据隐窝细胞丢失和
[16]
库（http：//string-db.org/），将物种限定为“Homo sapiens”， 炎症细胞浸润程度进行病理学评分 。

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