Page 36 - 《中国药房》2024年20期
P. 36

[3]
          进 其 生 长 。 丝 裂 原 活 化 蛋 白 激 酶 激 酶（mitogen-            2.2 耐药细胞株构建
          activated protein kinase kinase，MEK）/胞外信号调节激酶           将对数生长期的 Huh7 细胞，用含 1.24 μmol/L Len
         （extracellular signal-regulated kinase，ERK）常介导细胞     的培养基进行培养，隔日更换一次含药培养基；待细胞
          表面到细胞核的信号传导，以调控基因表达、细胞周期                            贴壁稳定生长（约 2～3 周）后，用不加药的培养基培养
                                         [4]
          过程和细胞凋亡，参与肿瘤恶性进程 。已有研究报道，                           3～5 d开始传代；然后逐渐增加Len浓度重复上述操作，
          FAK、MEK/ERK具有双重抑制协同作用，抑制其表达能                        每次增加 0.4 μmol/L，增加 22 次，共培养 120 d，最终得
          有效抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡，发挥抗肿                            到在含 10.4 μmol/L Len 的培养基中稳定生长的耐药细
                                                                          [6]
          瘤和细胞毒性作用 。为此，本研究基于 FAK/MEK/                         胞株Huh7/Len 。
                            [5]
          ERK 信号通路考察了 CSL 对 LC 细胞耐药性的影响，以                     2.3 细胞分组与给药
          期为LC的治疗提供参考。                                            将Huh7/Len细胞分为对照组，CSL低、中、高浓度组
                                                                                 [7]
          1 材料                                               （1、2.5、5 μmol/L CSL） ，CSL高浓度+Zn27组（5 μmol/L
                                                                                [8]
          1.1 主要仪器                                            CSL+2 nmol/L Zn27） 。每组设置6个复孔。
                                                              2.4 细胞增殖能力考察
              本研究所用主要仪器包括 Apogee A50 型流式细胞
                                                                  取对数生长期的 Huh7/Len 细胞，按“2.3”项下方法
          仪、FLUOstar OPTIMA 酶标仪（广州进科驰安科技有限
                                                              分组，对照组细胞用完全培养液（下同）制成细胞悬液，
                              ®
                       ®
          公司）；Corning Axygen 凝胶成像系统（上海辅泽商贸有
                                                              其余各组细胞用含相应药液的培养液（下同）制成细胞
          限公司）；Mini Spin 型离心机（德国 Eppendorf 公司）；
                                                                          3
                                                              悬液，以 1×10 个/孔接种至 96 孔板中，每孔 200 μL，分
          XPR204S/AC 型电子天平[梅特勒-托利多国际贸易（上
                                                              别常规培养 24、48、72 h。培养结束后每孔加入 MTT 溶
          海）有限公司]；IX73型显微镜（日本Olympus公司）等。
                                                              液 20 μL，继续培养 4 h，弃上清液，加入二甲基亚砜 150
          1.2 主要药品与试剂
                                                              μL，用酶标仪于 490 nm 波长处测定吸光度。吸光度越
              CSL（批号 jcsj01830，纯度≥98%）、DMEM 培养基
                                                              大，表示活细胞数量越多，提示细胞增殖越快。实验重
         （批号 OD20230627）、仑伐替尼（lenvatinib，Len）（批号
                                                              复3次。
          N77227，纯 度 ≥99%）、MTT 细 胞 增 殖 试 剂 盒（批 号
                                                              2.5 细胞克隆能力考察
          A78381）、BCA试剂盒（批号A80223）均购于上海机纯实
                                                                  收集“2.4”项下分组干预 24 h 的细胞，制成细胞悬
          业有限公司；FAK 激活剂 ZINC40099027（Zn27）（批号
                                                              液，以 700 个/孔接种至 6 孔板中，常规培养 10 d，期间每
          464101）购于武汉艾美捷科技有限公司；膜联蛋白 V
                                                              隔 3 d 换一次培养液。克隆形成后（以集落细胞数超过
         （Annexin V）-异硫氰酸荧光素（FITC）/碘化丙啶（PI）试
                                                              50 个作为有效克隆），用磷酸盐缓冲液洗涤，以 4% 聚甲
          剂盒（批号 997103）购于江苏麦格生物科技有限公司；
                                                              醛和0.1%结晶紫固定染色，通过显微镜拍照并观察，统
          ROS 试剂盒（批号 20231226）购于上海晶抗生物工程有
                                                              计各组细胞克隆数。
          限公司；兔源磷酸化FAK（phosphorylated FAK，p-FAK）、
                                                              2.6 细胞凋亡率检测
          B细胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相关X               收集“2.4”项下分组干预 24 h 的细胞，制成细胞悬
          蛋 白（Bcl-2  associated  X  protein，Bax）、磷 酸 化 MEK    液，以1×10 个/孔接种至6孔板中，待细胞贴壁后，用胰
                                                                        5
         （phosphorylated  MEK，p-MEK）、磷 酸 化 ERK（phos‐          酶消化并收集至离心管中，加入Binding Buffer溶液300
          phorylated ERK，p-ERK）、胱天蛋白酶 3（caspase-3）、甘          μL重悬，再加入Annexin V-FITC 5 μL避光染色15 min，
          油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehy‐         加入PI 5 μL染色5 min，通过流式细胞仪测定细胞凋亡
          drogenase，GAPDH）抗 体（ 批 号 分 别 为 ab81298、             率：细胞凋亡率（%）＝右上象限[（Annexin V-FITC）/PI ]
                                                                                                            +
                                                                                                         +
          ab194583、ab263897、ab4750、ab201015、ab13847、ab9485）   凋亡率+右下象限[（Annexin V-FITC）/PI ]凋亡率。实
                                                                                              +
                                                                                                 －
          和山羊抗兔IgG二抗（批号ab97080）均购于英国Abcam                     验重复3次
          公司。                                                 2.7 细胞侵袭能力考察
          1.3 细胞                                                  收集“2.4”项下分组干预 24 h 的细胞，制成细胞悬
              人LC细胞株Huh7（货号CL-0120）购于武汉益普生                    液，调整密度为 1×10 个/mL，取 200 μL 加入 Transwell
                                                                                 5
          物科技有限公司。                                            小室上室（2×10 个/孔）；下室加入含10%胎牛血清的培
                                                                            4
          2 方法                                                养基750 μL；聚碳酸酯膜上室侧铺一层基质胶。常规培
          2.1 细胞培养                                            养 24 h，收集穿膜细胞，洗涤后用 4% 聚甲醛固定 30
              将解冻复苏后的 Huh7 细胞，用 DMEM 培养基于                     min，再用 0.1% 结晶紫染色 15 min，在显微镜下，随机选
          37 ℃、5%CO2环境中常规培养，取对数生长期的Huh7细                      取 5 个视野观察穿膜细胞并通过 Image J 软件统计细胞
          胞完成传代和后续实验。                                         侵袭数。


          · 2478 ·    China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 20                            中国药房  2024年第35卷第20期
   31   32   33   34   35   36   37   38   39   40   41