Page 55 - 《中国药房》2024年19期

（2）偏最小二乘法-判别分析。以 14 种样品中的 6 35
种有效成分含量作为变量导入SIMCA 14.1软件进行偏 30 PPO
POD
最 小 二 乘 法 - 判 别 分 析（partial least square method- 25
discriminant analysis，PLS-DA），结合变量重要性投影 20
[13]
（variable importance in projection，VIP）值 分析（图 2）， 酶活性/U 15
以 VIP 值＞1 为标准筛选不同样品间的差异性标志物。 10
结果显示，绿原酸（VIP值为1.347 4）、3，5-O-咖啡酰基奎 5
宁酸（VIP值为1.285 71）、黄芩苷（VIP值为1.195 22），可 0
S1 R8 B2 W2 ZS2 WS2
能是导致样品间产生差异的主要原因。 不同干燥方式样品
图3 不同干燥方式样品中PPO、POD活性测定结果
1.5
2.5 稳定性测试
0.5
VIP值 －0.5 取样品 S1、R8、B2、W2、ZS2 和 WS2，置于阴凉干燥
－1.5 处放置1个月，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，然后
绿原酸 3，-O-咖啡 酰基奎宁酸 黄芩苷 木犀草素 木犀草苷 槲皮素 按“2.3.5”项下方法测定样品中6种有效成分的含量。每
5
有效成分 份样品测定3次，结果取平均值（表6）。结合表4结果对
图2 绿原酸等6种有效成分的VIP值得分图 放置1个月前后样品中6种有效成分含量的差异进行比
较，含量变化倍数结果见图4。
2.4 氧化相关酶活性测定
表6 放置 1 个月后样品中绿原酸等 6 种有效成分的含
[14]
参考崔莉等 所用方法，对样品 S1、R8、B2、W2、
量测定结果（n＝3，%%）
ZS2和WS2中多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）、过
样品编号 绿原酸 木犀草苷 3，5-O-咖啡酰基奎宁酸 黄芩苷 木犀草素 槲皮素
氧化物酶（peroxidase，POD）的活性进行测定。 S1 0.436 9 0.202 6 1.029 5 1.655 7 0.103 4 0.107 7
2.4.1 酶液提取 R8 0.699 3 0.236 2 1.202 4 2.593 5 0.070 1 0.076 0
B2 0.396 2 0.252 5 1.565 2 1.616 0 0.162 8 0.081 3
称取上述6种祁菊花样品各1.00 g，置于研钵中，用
W2 0.816 5 0.350 9 1.685 8 3.609 6 0.170 3 0.138 3
20 mmol/L 的 Tris-HCl 缓冲液（pH7.5，含 3% 曲拉通 X- ZS2 0.748 2 0.359 0 1.972 6 2.680 4 0.576 4 0.148 6
100 和 1%PVP）10 mL 冰浴研磨提取。将提取物在 4 ℃ WS2 0.789 5 0.325 6 1.688 3 3.216 6 0.135 2 0.092 8
下以10 000 r/min离心10 min，收集上清液作为粗酶液， 12 绿原酸
3，5-O-咖啡酰基奎宁酸
置于4 ℃冰箱中保存备用。 黄芩苷
10 木犀草素
木犀草苷
2.4.2 PPO、POD活性测定 槲皮素
（1）PPO活性测定：该酶促反应以左旋多巴为底物， 8
反应体系包括2.95 mL 5 mmol/L的左旋多巴溶液（用20 有效成分含量倍数变化 6
mmol/L Tris-HCl 缓冲液配制）和 0.05 mL 粗酶液。使用
酶标仪测定475 nm波长处吸光度（A）的变化，在室温下 4
反应20 min后开始记录，每隔20 s记录1次，连续测定5
2
min。实验重复 3 次，结果取平均值。以每分钟 A 增加
0.001 为 1 个 PPO 活性单位。（2）POD 活性测定：该酶促 0 S1 R8 B2 W2 ZS2 WS2
反应以愈创木酚为底物，反应体系包括 2.95 mL 10 不同干燥方式样品
图4 放置 1 个月前后样品中绿原酸等 6 种有效成分含
mmol/L 的愈创木酚溶液、0.02 mL 10 mmol/L 的 H2O2溶
量倍数的变化
液（用 20 mmol/L Tris-HCl 缓冲液配制，pH7.5）和 0.03
mL 粗酶液。使用酶标仪测定 470 nm 波长处 A 的变化， 结果显示，6 个样品中绿原酸、木犀草苷、3，5-O-咖
室温下反应20 min后开始记录，每隔20 s记录1次，连续 啡酰基奎宁酸含量依然符合药典要求，且6个样品在放
测定5 min。实验重复3次，结果取平均值。以每分钟A 置1个月后其中的6种有效成分含量均不同程度减少。
增加0.001为1个POD活性单位。结果见图3。 2.6 表面微观形态检查
结果显示，样品ZS2、WS2中PPO活性丧失，其余样 将 S1、R8、B2、W2、ZS2 和 WS2 样品分别粉碎成小
品中 PPO 活性大小依次为 S1＞R8＞B2＞W2；除样品 于2 mm的碎片，置于样品架上并涂上金钯，使用扫描电
R8外，其余样品中POD活性均已完全丧失。由此可知， 子显微镜（scanning electron microscope，SEM）在5 kV加
杀青干燥可能是灭活样品中PPO和POD的最佳方法。 速电压下观察各干燥花瓣表面的微观形貌，详见图5。

中国药房 2024年第35卷第19期 China Pharmacy 2024 Vol. 35 No. 19 · 2369 ·