Page 40 - 《中国药房》2024年19期
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2.2 取材和脏器指数的计算                                      织适量，提取总蛋白，采用BCA蛋白试剂盒检测样品的
              注射刀豆蛋白 A 溶液 12 h 后，采用戊巴比妥钠（45                   蛋白浓度；调整浓度，放入沸水中煮 10 min，使蛋白变
          mg/kg）麻醉小鼠，摘眼球取血后处死。血样以 4 000                       性。将制备好的凝胶玻璃板安装在电泳槽中，倒入 1×
           r/min 离心 15 min，取上层血清用于肝功能指标及炎症                    电泳缓冲液，在上样孔中加入10 μL蛋白样品，于110 V
          因子水平的测定；收集小鼠肝脾组织，分别称质量，再计                           电压下电泳 90 min，转移至 PVDF 膜上，用 5% 脱脂奶粉
          算肝脾指数（肝脾指数＝脏器质量/体重×100%）。取一                         封闭 2 h；加入 TLR4、NF-κB、Nrf2、HO-1 和 β-actin 蛋白
          部分肝组织以4%多聚甲醛固定，用于病理学形态观察，                           一抗（稀释比例均为 1∶1 000），在 4 ℃下孵育过夜；用
          余下肝组织和血清均保存于－80 ℃冰箱，用于后续                            TBST 洗膜 3 次，加入相应二抗，在室温下孵育 1 h；用
          实验。                                                 TBST洗膜3次，加入ECL显影，曝光，拍照。采用Image
          2.3 小鼠肝脾组织病理学形态观察                                   J 软件计算蛋白条带灰度值，以目标蛋白与内参蛋白
              每组随机取 3 只小鼠的肝脾组织适量，以 4% 多聚                      β-actin的灰度值比值表示目标蛋白的表达水平。
          甲醛固定，经脱水、石蜡包埋、切片后，采用 HE 染色，然                        2.8 统计学方法
          后置于光学显微镜下观察，并对小鼠肝脾损伤程度进行                                采用 GraphPad Prism 8.0 软件进行统计学分析。符
                       [10]
          评分，具体如下 ——（1）肝损伤评分标准：肝细胞正常
                                                              合正态分布的数据以x±s表示，多组间比较采用单因素
          无坏死，计0分；肝细胞轻微肿胀，个别肝细胞坏死，计1
                                                              方差分析，组间两两比较采用 LSD-t 检验。检验水准
          分；肝小叶不超过1/3的肝细胞坏死，出现聚集性炎症细
                                                              α＝0.05。
          胞浸润，计 2 分；肝小叶 1/3～1/2 肝细胞坏死，出现大量
                                                              3 结果
          炎症细胞浸润，计3分；肝小叶超过1/2肝细胞坏死，出现
                                                              3.1 柴胡多糖对ALI小鼠肝脾指数的影响
          大量炎症细胞浸润，计4分。（2）脾损伤评分标准：脾细胞
                                                                  与正常组比较，模型组小鼠肝脾指数均显著升高
          正常无坏死，计0分；脾细胞轻度充血或出血，计1分；脾
                                                             （P＜0.01）；与模型组比较，柴胡多糖高剂量组小鼠肝脾
          细胞轻度充血或出血，少许淋巴细胞减少，计2分；脾细
                                                              指数均显著降低（P＜0.05或P＜0.01）。结果见表1。
          胞中度充血或出血，大量淋巴细胞减少，计3分；脾细胞
                                                                 表1 各组小鼠肝脾指数的比较（x±s，n＝8，%%）
          严重充血或出血，大量淋巴细胞减少，计4分。
                                                              组别                       肝指数           脾指数
          2.4 小鼠血清中肝功能指标水平检测
                                                              正常组                      4.48±0.22     0.35±0.04
              取“2.2”项下各组小鼠的血清样品适量，按照试剂盒                       模型组                      5.27±0.21 a   0.54±0.12 a
          说明书方法操作，检测小鼠血清中 ALT、AST、LDH 的                       阳性对照组                    5.09±0.15     0.46±0.09
                                                              柴胡多糖低剂量组                 5.02±0.18     0.45±0.04
          水平。                                                 柴胡多糖高剂量组                 4.87±0.24 b   0.43±0.02 c
          2.5 小鼠肝组织中氧化应激指标水平检测                                   a：与正常组比较，P＜0.01；b：与模型组比较，P＜0.01；c：与模型组
              取各组小鼠肝组织适量，加入生理盐水进行匀浆，                          比较，P＜0.05。
          然后以12 000 r/min离心10 min；取上清液适量（剩余部                  3.2 柴胡多糖对ALI小鼠肝脾组织病理学的影响
          分保存备用），按试剂盒说明书方法操作，检测小鼠肝组                               正常组小鼠肝细胞排列紧密、界限清晰，细胞质丰
          织中SOD、MDA水平。                                        富、着色均匀，细胞核大小正常；脾细胞形态正常，淋巴
          2.6 小鼠血清和肝组织中炎症因子水平的检测                              细胞排列紧密。模型组小鼠肝细胞空泡变性或明显坏
              取“2.2”项下各组小鼠的血清样品和“2.5”项下剩余                     死，并出现大量炎症细胞浸润；脾细胞体积增大、严重充
          肝组织匀浆上清液，按照试剂盒说明书操作，检测小鼠                            血并有出血现象，且淋巴细胞大量减少。与模型组比
          血清和肝组织中TNF-α、IL-6和IL-1β的水平。                         较，各给药组小鼠肝脾组织病理损伤均有所缓解，且阳
          2.7 小鼠肝组织中通路相关蛋白表达水平的检测                             性对照组和柴胡多糖高剂量组小鼠肝、脾损伤评分均显
              采用 Western blot 法检测。各组取 3 只小鼠的肝组                著降低（P＜0.05或P＜0.01）。结果见图1、图2、表2。







                          100 μm              100 μm              100 μm             100 μm               100 μm
                 A.正常组               B.模型组             C.阳性对照组           D.柴胡多糖低剂量组          E.柴胡多糖高剂量组
             注：黑色箭头所指为肝细胞空泡，红色箭头所指为出血和渗血，黄色箭头所指为炎症细胞浸润，蓝色箭头所指为肝细胞坏死。
                                    图1 各组小鼠肝组织病理学形态观察结果（HE染色）


          · 2354 ·    China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 19                            中国药房  2024年第35卷第19期
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