Page 33 - 《中国药房》2024年19期
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替），自由摄食饮水。本实验方案经河南省中医药研究                           醉大鼠，腹主动脉取血，静置30 min后，以3 000 r/min离
          院实验动物福利伦理审查委员会审核和批准（伦理审查                           心10 min分离血清，按照试剂盒说明书方法检测大鼠血
          批件号为HNTCMDW-20230214）。                             清中 IL-1β、IL-10、IL-17、TNF-α、25（OH）D3、MPO、NE
          2 方法                                               和NETs的水平。
          2.1 药物制备                                           2.5 大鼠踝关节病理学形态观察
                                          [8]
              参考本课题组前期研究方法制备 ：将防风饮片粉                             采用 HE 染色法观察。采血后处死大鼠，小心分离
          碎过 40 目筛，称取 1 kg 粉末，加入 95% 乙醇 8 L 加热回              其右后踝关节，置于4%多聚甲醛溶液中固定48 h，经脱
          流提取 2 次，每次 1.5 h，合并滤液并回收溶剂至无乙醇                     钙、脱水、透明、石蜡包埋后，进行常规切片。取部分组
          气味，得乙醇提取物。残渣用6 L蒸馏水煎煮2次，每次                         织切片（剩余部分用于CitH3表达水平的检测）置于二甲
          1.0 h，合并滤液，浓缩干燥后得水提取物。将乙醇提取                        苯中脱蜡后放入梯度乙醇中水化，随后将切片放入苏木
          物与水提取物混合后用适量蒸馏水制成混悬液，用等体                           素染液中染色 5 min，用流水冲洗后再浸入伊红染液中
          积的石油醚萃取4次，合并萃取液，减压浓缩，得石油醚                          染色2 min，经中性树胶封固后，采用显微镜观察大鼠踝
          提取物 22.73 g，得率为 2.27%。采用高效液相色谱法检                   关节病理学形态改变情况。
          测石油醚提取物中香柑内酯、异欧前胡素含量分别为                            2.6 大鼠踝关节中CitH3表达水平的检测
          16.43、9.27 mg/g。实验时取石油醚提取物溶于 2% 吐                      采用免疫组化法检测。取大鼠踝关节组织切片，脱
          温-80溶液后使用。
                                                             蜡水化，以柠檬酸钠抗原修复液修复、10% 正常山羊血
          2.2 动物分组、造模与给药
                                                             清室温封闭1 h，随后滴加CitH3一抗（稀释度为1∶300），
              大鼠适应性饲养 5 d 后，随机分为正常组（10 只）和
                                                             4 ℃孵育过夜，然后以磷酸盐缓冲液冲洗3次；滴加二抗
          造模组（60只）。将牛Ⅱ型胶原溶液（2.0 g/L，用0.1 mol/L
                                                            （稀释度为1∶500），37 ℃孵育30 min，再次清洗3次后滴
          醋酸溶解）与等体积的弗氏完全佐剂混合乳化，制成含
                                                             加 DAB 显色，以苏木素复染，经分化、冲洗、返蓝、梯度
          牛Ⅱ型胶原（1 g/L）的乳化剂。造模组大鼠于5个点（背
                                                             乙醇脱水后，以二甲苯透明、封片，再置于显微镜下观
          部 3 个点、尾根部及右后足跟部各 1 个点，0.1 mL/点）注
                                                             察。采用Image-Pro Plus 6.0软件分析CitH3蛋白的阳性
          射乳化剂；7 d后每只大鼠于尾根部再次注射乳化剂0.2
                                                             表达水平，结果以平均光密度值表示。每张切片随机选
                                        [9]
          mL 以加强免疫，建立 RA 大鼠模型 。正常组大鼠不造
                                                             3个视野分析，取其平均值。
          模，仅在相应部位注射等体积生理盐水代替。14 d后进
                                                             2.7  大 鼠 滑 膜 组 织 中 CYP24A1、CYP27B1、VDR、
          行关节炎指数（arthritis index，AI）评分，具体评分标准
                                                             PAD4表达水平的检测
          为：关节无发红、无肿胀记为0分；足趾关节轻度肿胀或
                                                                 采用 Western blot 法检测。分离各组大鼠右后膝关
          局部发红记为1分；足趾至足背肿胀或发红记为2分；踝
                                                             节滑膜组织，加入裂解液研磨后提取总蛋白，分离上清
          关节及以下红肿且活动轻微受限记为3分；关节严重红
                                                             液，根据 BCA 蛋白定量试剂盒说明书方法检测蛋白浓
          肿、畸形、僵硬且活动明显受限记为4分；四肢累计得分
                                                             度。取蛋白样品适量，加入5×上样缓冲液煮沸变性，取
                                                      [10]
          为AI评分，最高分为16分，评分≥4分视为造模成功 。
                                                             等量蛋白经12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳
              选取造模成功的大鼠 40 只按随机数字表法分为模
                                                             在120 V分离60 min，通过200 mA恒流将蛋白电转至聚
          型组和防风石油醚提取物低、中、高剂量组（55、110、220
          mg/kg，相当于防风生药临床等效剂量的 2.5、5、10 倍），                  偏二氟乙烯膜上，加 5% 脱脂奶粉室温封闭 1 h；弃封闭
          每组 10 只。正常组和模型组大鼠灌胃等体积 2% 吐                        液后漂洗 3 次，分别加入 CYP24A1（稀释度为 1∶800）、
          温-80溶液，其余各组大鼠灌胃相应药物，每天1次，连续                        CYP27B1（稀释度为 1∶1 000）、VDR（稀释度为 1∶800）、
          28 d。实验期间，观察大鼠的一般情况，包括大鼠毛发色                        PAD4（稀释度为 1∶800）及 GAPDH 一抗（稀释度为 1∶
          泽、精神状态、活动情况、关节肿胀等的变化。                              5 000），4 ℃孵育过夜；漂洗3次，滴加相应二抗（稀释度
          2.3 大鼠足趾肿胀度及AI评分                                   为 1∶8 000）室温孵育 60 min，然后滴加 ECL 发光液曝
              分别于给药前及给药后第 7、14、21、28 天用足趾容                   光，采用凝胶成像仪拍照，以目的蛋白与内参蛋白
          积测量仪测量大鼠右后足容积，以与造模前的足趾容积                           GAPDH的灰度值比值表示目的蛋白的表达水平。
          差值为足趾肿胀度。定期观察大鼠足趾及关节红肿、畸                           2.8 统计学方法
          形、活动等情况，并进行AI评分。                                       采 用 SPSS  26.0 软 件 分 析 数 据 。 计 量 资 料 经
          2.4 大鼠血清中炎症因子、25（OH）D3、MPO、NE 和                    Shapiro-Wilk检验均服从正态分布，以x±s表示，多组间
          NETs的检测                                            比较采用单因素方差分析，组间两两比较使用 LSD-t 检
              采用ELISA法检测。末次给药24 h后，用异氟烷麻                     验。检验水准α＝0.05。


          中国药房  2024年第35卷第19期                                              China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 19    · 2347 ·
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