Page 50 - 《中国药房》2024年17期

2 方法 表1 NAFLD活动度评分标准
2.1 NAFLD模型大鼠制备与分组、给药 评分/分 肝组织脂肪变性比例 肝小叶炎症细胞浸润灶/个 肝细胞气球样变性
0 ＜5% 0 无
取 63 只大鼠参考文献[12]方法以高脂饲料饲养的
1 5%～33% ＜2 少部分
方法制备 NAFLD 模型。饲养 8 周后随机处死 3 只大鼠 2 ＞33%～66% 2～4 很多
以 HE 染色进行肝组织病理检测，若肝组织呈现出脂肪 3 ＞66% ＞4 －
变性、肝细胞变性坏死、炎症细胞浸润，且内有脂滴分布 维着色情况，选任意视野拍照，以Image J软件分析肝组
并发生气球样病变等病理损伤症状时，则表明 NAFLD 织病理图像，定量其中呈蓝色的胶原纤维面积（记为S1）
大鼠模型制备成功。将造模成功的 60 只大鼠随机分为 与视野切片总面积（记为S2），计算肝组织胶原容积分数
模型组、车叶草苷低剂量组（14 mg/kg，灌胃，剂量参考文 （collagen volume fraction，CVF），CVF＝S1/S2×100%。
献[11]设置）、车叶草苷高剂量组（28 mg/kg，灌胃，剂量 2.5 大鼠血清中纤维化相关因子、促纤维化因子与促炎
参考文献[11]设置）、车叶草苷高剂量+pc-NC组（灌胃车 因子水平检测
叶草苷 28 mg/kg+尾静脉注射 pc-NC 50 µg，pc-NC 剂量 取“2.2”项下血清样品，于冰水浴中解冻，取 600 µL
根据质粒说明书设置）、车叶草苷高剂量+pc-SphK1 组 采用ELISA法检测其中纤维化相关因子（PCⅢ、Ⅳ-Col、
（灌胃车叶草苷 28 mg/kg+尾静脉注射 pc-SphK1 50 µg， LN）、促纤维化因子（TGF-β1 ）与促炎因子（IL-1β、iNOS、
pc-SphK1 剂量根据质粒说明书设置），每组 12 只；另选 IL-6）水平，具体步骤按相应试剂盒说明书方法操作。
12只大鼠作为对照组（以正常饲料饲养8周）。对照组、 2.6 大鼠肝组织中胶原形成与SphK1/S1P信号通路相
模型组以生理盐水代替进行灌胃与尾静脉注射，其余各 关蛋白表达检测
组大鼠灌胃或尾静脉注射相应药物或质粒，灌胃处理每 取“2.2”项下大鼠肝组织，放入含有适量 RIPA 裂解
天1次，尾静脉注射处理每周2次，均连续3周。 液的玻璃匀浆管中，冰水浴中高速研磨后离心（4 ℃，20
2.2 大鼠血脂、肝功能指标检测及标本采集 min，1 500×g），取上清液；采用BCA法检测上清液中蛋
末次给药后 24 h，以吸入乙醚的方式麻醉大鼠，断 白含量，然后沸水浴中煮沸变性蛋白。配制浓缩胶与分
尾取血，离心（4 ℃，10 min，500×g），取部分上层血清
离胶，取变性蛋白样品（25 µg）上样，恒定电压（120 V）下
（剩余部分置于－20 ℃保存备用）采用全自动生化分析
进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后稳定
仪检测其中血脂指标[游离脂肪酸（free fat acid，FFA）、
电流（40 mA）下转印至聚偏二氟乙烯膜上；以 5% 脱脂
总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，
牛奶封闭，加入Ⅰ-Col、Ⅳ-Col、SphK1、S1P、GAPDH 一
TG）]和肝功能指标[天冬氨酸转氨酶（aspartate transami‐
抗（稀释比例均为1∶2 000）于4 ℃下孵育12 h；加入相应
nase，AST）、丙氨酸转氨酶（alanine transaminase，ALT）]
二抗（稀释比例为1∶1 000）于室温下孵育2 h；以ECL显
水平。
影后成像，并用 Image J 软件定量蛋白灰度值，以内参
上述实验结束后，脱颈处死大鼠，开腹取出肝脏，剪
GAPDH 蛋白灰度值为基准量化Ⅰ-Col、Ⅳ-Col、SphK1、
下约0.4 g肝组织保存在液氮中备用，自剩余肝组织上剪
S1P蛋白表达水平。
下约1 cm×1 cm×0.5 cm大小的组织块，在生理盐水中
2.7 统计学方法
漂洗后以包埋剂包埋，于液氮中迅速冷冻后在冷冻切片
采用SPSS 26.0软件对数据进行统计分析。数据以
机中连续切片，即得4～6 µm的切片备用。
x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两
2.3 大鼠肝组织病理变化观察
比较采用SNK-q检验。检验水准α＝0.05。
取“2.2”项下肝组织切片，于室温下静置复温，5 min
3 结果
后放入预冷丙酮中固定；12 min 后取出采用 HE 染色试
剂盒行 HE 染色，具体步骤按试剂盒说明书方法操作。 3.1 车叶草苷对大鼠血脂和肝功能指标的影响
采用显微镜观察肝组织病理形态，选任意视野拍照，分 与对照组比较，模型组大鼠血清中 TC、TG、FFA、
[13]
析肝组织病理图像并对 NAFLD 活动度进行评分 ，具 AST、ALT 水平显著升高（P＜0.05）。与模型组比较，车
体评分标准见表1（评分由3个部分评分加和得到，总分 叶草苷低、高剂量组大鼠血清中上述指标水平均显著降
为0～8分）。 低（P＜0.05）。与车叶草苷低剂量组比较，车叶草苷高
2.4 大鼠肝纤维化情况观察 剂量组大鼠上述指标水平均显著降低（P＜0.05）。与车
取“2.2”项下肝组织切片，按“2.3”项下方法固定，采 叶草苷高剂量组、车叶草苷高剂量+pc-NC组比较，车叶
用 Masson 染色试剂盒行 Masson 染色，具体步骤按试剂 草苷高剂量+pc-SphK1组大鼠血清中上述指标水平均显
盒说明书方法操作。采用显微镜观察肝组织中胶原纤 著升高（P＜0.05）。结果见表2。

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