Page 37 - 《中国药房》2024年14期
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心提供。所有小鼠均饲养于温度（23±2）℃、相对湿度                         2×ChamQ 通用 SYBR qPCR 预混液 10 μL，正、反向引
          50%～70%、每 12 h 光照/黑暗循环的动物房内，自由摄                    物各 0.5 μL，cDNA 模板 7 μL，加 ddH2O 至 20 μL。反应
          食、饮水。本研究饲养环境符合实验动物环境设施要                            条件包括预变性处理（94 ℃，5 min）、循环反应（95 ℃，5
          求，实验方案经广东药科大学实验动物伦理委员会批准                           s；60 ℃，30 s；共 40 次）、熔解曲线反应（95 ℃，15 s；
         （受理编号gdpulacspf2022193）。                            60 ℃，60 s；95 ℃，15 s）。以 GAPDH 为内参，采用 2       －ΔΔCt
          2 方法                                               法计算各目的基因的表达水平，结果以HFD组为参照进
          2.1 动物实验                                           行归一化处理。qPCR引物序列及产物长度见表1。
          2.1.1 分组、造模与给药                                               表1 qPCR引物序列及产物长度
              采用随机数字表法将 24 只雄性小鼠分为 SCD 组、                     目的基因       正向引物               反向引物       产物长度/bp
                                                              IL-18  5′-GACAGAATGTGTTCGAGGAT-3′ 5′-TAATTCACAGAGAGGGTCACA-3′  127
          模型组（HFD组）、Sin低剂量组（Sin-L组）、Sin高剂量组
                                                              IL-1β  5′-CCGTGGACCTTCCAGGATGA-3′ 5′-GGGAACGTCACACACCAGCA-3′  117
         （Sin-H组），每组6只。SCD组小鼠以SCD正常喂养，其                       GAPDH  5′-AGGAGTAAGAAACCCTGGAC-3′ 5′-CTGGGATGGAATTGTGAG-3′  109
          余组小鼠均以HFD连续饲养24周以复制NASH模型 。
                                                      [12]
                                                             2.1.7 小鼠肝组织中相关蛋白表达检测
          于 17 周起，Sin-L、Sin-H 组小鼠分别灌胃 50、100 mg/kg
                                                                 采用 Western blot 法检测。取各组小鼠肝组织适
                                       [13]
          Sin（剂量根据既往研究结果确定 ，以生理盐水为溶
                                                             量，加入 RIPA 裂解液于冰上裂解 30 min，随后于 4 ℃下
          剂），SCD组和HFD组小鼠灌胃等体积生理盐水，每天1
                                                             以12 000 r/min离心30 min，取上清液，以BCA法测定蛋
          次，连续8周。                                            白浓度后作变性处理。取变性蛋白适量，进行十二烷基
          2.1.2 取材                                           硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转膜，以5%脱脂奶
              末次给药后 12 h，称定并记录小鼠体重，腹腔注射                      粉室温封闭 1 h；加入内参蛋白（GAPDH）、炎症相关蛋
          0.3% 戊巴比妥麻醉后摘眼球取血，血样于 4 ℃下以                        白（IL-1β、cleaved-IL-1β）、纤维化相关蛋白（Col-Ⅰ、
          3 000 r/min离心15 min，取上层血清，用于血清肝功能指                 α-SMA、CTGF）、AMPK/YAP信号通路相关蛋白（AMPK、
          标和炎症因子含量的检测；取血后处死各组小鼠，分离                           p-AMPK、YAP、p-YAP）一抗（稀释比例均为1∶1 000），于
          其肝脏，称定质量后用于肝脏指数测定，病理学观察，                           4 ℃下孵育过夜；洗膜后，加入相应二抗（稀释比例为
          TG、TC含量检测，以及qPCR和Western blot实验。                   1∶10 000），于室温下孵育 1 h；洗膜后，以 ECL 显影并在
          2.1.3 小鼠肝脏指数的测定                                    化学发光成像系统下成像。使用Image J 1.47软件计算
              取各组小鼠肝脏，用滤纸吸干表面水分，按下式计                         IL-1β、cleaved-IL-1β、Col-Ⅰ、α-SMA、CTGF蛋白的表达
          算肝脏指数：肝脏指数＝小鼠肝脏质量/体重×100%。                         水平（即上述蛋白与内参蛋白 GAPDH 的条带灰度值比
          2.1.4 小鼠TG、TC、肝功能指标和炎症因子检测                         值）和 AMPK、YAP 蛋白的磷酸化水平（即 p-AMPK 与
              取各组小鼠肝组织适量，加入RIPA裂解液，研磨匀                       AMPK蛋白、p-YAP与YAP蛋白的条带灰度值比值），结
          浆，以12 000 r/min离心30 min（重复2～3次），合并上清               果以SCD组为参照进行归一化处理。
          液，按相应试剂盒说明书操作，使用酶标仪检测肝组织                           2.2 细胞实验
          中 TG、TC 含量。取各组小鼠血清样品适量，按相应试                        2.2.1 细胞培养
          剂盒说明书操作，使用酶标仪检测血清中AST、ALT、IL-                          将HepG2细胞接种于含10%胎牛血清、1%青霉素-
          1β、IL-18含量。                                        链霉素双抗的 DMEM 培养基（即完全培养基）中，于
          2.1.5 小鼠肝组织病理学观察                                   37 ℃、5%CO2的条件下培养。
              取各组小鼠肝组织适量，用4%多聚甲醛固定后，依                        2.2.2 Sin干预浓度筛选
          次以水冲洗、乙醇梯度脱水，经透明、浸蜡、包埋、修块、                             采用MTT法检测。取HepG2细胞，以5 000个/孔接
          切片、展片、捞片、烘片、脱蜡后，分别进行 HE 染色和                        种到 96 孔板中，用不同浓度 Sin（0、50、100、150、200
          Masson染色，用于观察肝细胞脂肪变性和肝纤维化。另                        μmol/L，即 Sin 不同浓度组；Sin 浓度参考相关文献 设
                                                                                                         [14]
          取各组小鼠肝组织适量，剪成1.0 cm×1.0 cm的组织块，                    置）干预，并设置含细胞、不含药物的阴性对照组和不含
          经OCT胶包埋后，于－20 ℃下冷冻后切片，进行油红O                        细胞、不含药物的空白组，每组设置3个复孔。处理24 h
          染色，用于观察肝脏脂滴定位。                                     后，每孔中加入不含血清的DMEM培养基180 μL和0.5
          2.1.6 小鼠肝组织中IL-18、IL-1β mRNA表达检测                   mg/mL 的 MTT 试剂 20 μL，于 37 ℃下避光孵育 4 h；吸
              采用qPCR法检测。取各组（SCD组除外，主要考察                      弃上清液，每孔加入二甲基亚砜 150 μL，使用酶标仪在
          药物对模型小鼠炎症相关mRNA表达的影响）小鼠的肝                          570 nm 波长下检测每孔的吸光度（A）值，并按下式计算
          组织适量，按RNA提取试剂盒提取总RNA，对其进行定                         细 胞 存 活 率 ：细 胞 存 活 率 ＝（ASin不同浓度组 －A 空白组）/
          量分析后，按逆转录试剂盒说明书进行逆转录，以所得                          （A 阴性对照组－A 空白组）×100%，根据结果筛选后续细胞实验
          cDNA 为模板进行 PCR 扩增。反应体系共 20 μL，包括                   的Sin干预浓度。


          中国药房  2024年第35卷第14期                                              China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 14    · 1703 ·
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