Page 12 - 《中国药房》2024年14期
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条过滤掉    [22―23] 。                                   5.6 交叉污染判定
          5.3 数据统计                                                标签合成错误、样本间标签污染、实验过程中需要
              可使用 NanoStats 软件进行测序数据量的统计，包                    开盖而产生气溶胶污染等，均可造成同批次样本间的交
                                                                                                      [29]
          括测序序列数（reads）、碱基数（bases）、序列长度分布、平                   叉污染；一些强阳性样本也容易污染其他样本 。可通
          均测序质量值等 。不同样本类型、不同应用方向的检                            过设计相关测试实验或加入内参序列等方式估算样本
                        [21]
          测性能特点对数据量等统计指标有不同的要求，需进行                            交叉污染的比例，从而为后续结果解读提供参考。
          相关的测试实验以获得统计指标要求。                                   5.7 物种注释
              测序数据量指标的确定，一般与应用方向、产品检                              实验室需建立临床病原微生物的注释数据库，包括
          测限及样本类型等几个因素有关。（1）应用方向：相较于                          每种微生物的相关信息：比如物种分类（细菌、真菌、病
          tNGS，mNGS 检测的微生物靶标更多，且受人源宿主核                        毒、支原体/衣原体/螺旋体/立克次体、寄生虫等）、致病
          酸的影响更大，因此 mNGS 一般比 tNGS 需要的数据量                      性（致病、条件致病）、定植信息、临床意义等，以据此进
          更大。（2）产品检测限：检测限越低，需要的数据量越高。                         行后续的报告解读。
         （3）样本类型：一般情况下，肺泡灌洗液样本的病原微生                           6 报告解读
          物含量、丰度均较高，可能在数据量较低的情况下就能                                报告解读是一个排除干扰并确定感染病原微生物
          检出；而对于血液样本，病原微生物的丰度相对较低，且                           的过程，临床送检的样本多种多样，其定植菌、微生物比
          人源细胞含量较高，往往需要更高的数据量才能检出。                            例、空间异质性等的差异，会给临床解读报告造成困惑。
              对于序列读长分布，mNGS的序列片段是由微生物                         临床医师需密切结合患者的病史、感染指标、影像学、临
          基因组随机断裂而来，长度分布一般较随机，而tNGS的                          床表现、并发症、流行病学史、接触史等情况，同时结合
          片段长度取决于待测微生物引物设计时的引物扩增子                             检测数据的质控要求，判断检出的病原微生物是否符合
                                                                      [19]
          长度。例如，病毒等基因组较小的微生物，在测序过程                            临床诊断 ，如条件允许可进一步通过其他技术进行交
                                             [24]
          中更容易碎裂成短的片段（100 bp 左右） ，所以引物扩                       叉验证。
                                                                                                 [30]
          增子需要设计得更短一些，进而导致测序片段也较短。                                病原微生物的确认须遵循 Koch 法则 ：（1）该微生
          因此，扩增子长度会直接影响序列长度，通常序列长度                            物存在于同类疾病患者中，健康个体无此微生物；（2）该
          要求不小于最短扩增子长度。                                       微生物必须能够被分离、培养、纯化；（3）该微生物接种
          5.4 参考数据库比对及物种鉴定                                    于易感动物可引起相同疾病，并可从被接种的动物体内
              纳米孔测序因其较长的测序读长及直接测序的优                           分离得到该微生物；（4）该微生物可引起每一个个体发
          势，对于病原微生物检测可不进行组装拼接而直接进行                            病。但是，作为一种临床检验方法，利用纳米孔测序检
          比对分析，且序列比对特异性更高，分析流程更为简单。                           测到的病原微生物可能并不能够完全满足传统Koch法
                         [25]
          可使用Minimap2 等软件将纳米孔测序的reads跟参考                      则，作为该法则的补充，纳米孔测序的检测结果解读应
          序列数据库进行比对，获得物种鉴定分类信息。参考数                            满足如下要求：
          据库应选择质量较高的数据库，如美国 FDA 的 FDA-                        6.1 数据质控要求
                 [26]
          ARGOS 、美国国家生物技术信息中心（National Center                     不同应用方向的检测范围有较大差异。由于检测
                                                  [27]
          for Biotechnology Information，NCBI）的RefSeq 等。另      目标中可能包含不同数量的病原微生物、耐药基因、毒
          外，病原微生物的样本可能会带有宿主序列，因此，比对                           力基因，因此不同的测序方向对于评估测序质量的要求
          序列数据库也应包含人源参考基因组数据库，如Human                          自然也会有所不同。例如，mNGS由于检测的病原微生
          GRCh37/hg19 和 Human  GRCh38/hg38 基 因 组 数 据 库        物数量多且易受宿主核酸的影响，往往要求更大的数据
         （http：//genome.ucsc.edu/）。比对序列数据库应定期更                量；而tNGS检测的目标限定在少量特定病原微生物上，
          新，过滤删除冗余、不正确或组装质量较差的参考序列，                           少量数据即可满足检测要求。解读时应先根据不同产
          吸纳新发现的病原微生物基因组信息充实数据库。各                             品的技术要求确定是否满足样本质控要求，比如数据
          实验室应按照样本类型构建病原谱，每一微生物应含有                            量、片段长度、测序质量、内参含量等；若有样本不满足
          足够代表种及属水平的序列特征。                                     质控条件，应尽快对检测步骤和样本状态进行溯源排
          5.5 背景微生物过滤                                         查，确定原因，并采取进一步措施。
              病原检测流程中存在试剂工程菌、环境微生物及实                          6.2 阳性阈值及判读标准
          验室残留微生物，可造成测序污染，导致假阳性结果。                                理论上，凡存在于样本中的微生物均可检出，但因
          因此，各实验室需要构建背景数据库用于过滤污染序                             微生物基因组长度和样本类型等的差异，无法针对所有
          列。另外，对实验样本应设置无模板对照（no template                      微生物建立统一的阴性、阳性判读标准。各实验室应根
                                                      [28]
          control，NTC）样本，以监控背景微生物，并进行过滤 。                     据预期用途、样本类型、检测目标和技术特点，建立并验

          · 1678 ·    China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 14                            中国药房  2024年第35卷第14期
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