Page 11 - 《中国药房》2024年14期
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4.2 核酸提取                                           度要求及文库用量与实际应用方向和文库中核酸序列
              完整的核酸提取方法需经重复性和耐受量验证，保                         的长度有关。各实验室需要明确文库中核酸序列的长
          证提取核酸的完整性和纯度。应根据临床样本类型和                            度，以确定文库用量，例如用 WGS 检测 5 000 bp 左右的
          微生物种类建立有针对性的标准化提取程序，以保证不                           序列时，在上样量50 fmol情况下，需要170 ng的核酸。
          同类型病原微生物的提取效果。例如，针对真菌、分枝                           4.6 上机测序
          杆菌等特殊微生物，应保证其破壁效果；针对 RNA 病                             由于纳米孔测序芯片是生物蛋白孔，其保存、使用、
          毒、游离核酸，则应保证其提取效果。每次试验，都应包                          质控标准都要符合测序设备标注的标准流程。纳米孔
          括内参、阴性对照和阳性对照，以评估每批次样本中是                           测序芯片虽可多次使用，但“可用芯片”的标准也有具体
                                          [7]
          否存在操作或环境带来的污染等异常 。若使用自动提                           的要求。例如，初次使用的 MinION/GridION 芯片的可
          取仪，应避免交叉污染，且提取时间应控制在合适范                            用孔数应大于800，随着使用次数的增加，芯片可用孔数
          围内。                                                会有所减少，其数据产出速度和孔状态都会有不同程度
              提取核酸时，对于 DNA、RNA 是否需要分开提取，                     的下降。芯片是否可以继续使用应根据需要的数据量
          应结合应用方向和检测靶标综合考虑。若检测范围包                            及实验要求进行评估，根据 MinION/GridION 芯片的质
          括新发或未知病原（包括 RNA 病毒），进行 mNGS 检测                     控标准及测试报告，其最低应用标准为50孔。
          时应将 DNA 和 RNA 分开提取，以提高各类病原微生物                          测序数据量与预期用途（病原鉴定、耐药检测、WGS
          的无差别检出率。                                           等）、样本中人源核酸占比、芯片质量等有关。纳米孔测
          4.3 核酸质量验证                                         序仪可实时输出核酸序列信息，包括长度、质量、接头连
              各实验室应建立合格核酸样本的标准，包括纯度、                         接效果、孔状态、芯片稳定性、序列过孔速度等，应根据
          完整性及核酸含量。高纯度 DNA 的 A260/A280 （260 nm 与             应用目的的不同确定相应的测序标准。用户在使用过
          280 nm波长处的吸光度比值）应在1.7～1.9范围内，A260/                 程中应关注接头连接率及纳米孔利用率等指标，一般接
          A230 （260 nm与230 nm波长处的吸光度比值）应大于2.0。               头连接率应不低于 90%，纳米孔利用率应不低于 75%，
          高纯度 RNA 的 A260/A280应在 1.8～2.0 范围内，A260/A230应       序列过孔速度要求在 300 bp/s 以上，测序质量值应大于
                [19]
          大于2.0 。应采用合适的方法检测核酸完整性，若核酸                         Q9；不满足要求的应及时停止测序，予以补救。
                                                                 推
          降解严重则需要重新提取。每次提取的核酸样本应使                                推荐意见荐意见5：：纳米孔测序芯片清洗纳米孔测序芯片清洗、、使用应有标准化使用应有标准化
                                                             流程程，，应明确使用前的质控标准应明确使用前的质控标准，，依据样本类型及应用依据样本类型及应用
          用 Qubit 荧光染料进行定量测定，以确保核酸含量满足                       流
                                                             方向选择适合的数据量及测序时间等参数向选择适合的数据量及测序时间等参数；；测序过程中测序过程中
          后续实验要求。                                            方
          4.4 文库制备                                           应监控测序指标
                                                             应监控测序指标，，如过孔速度如过孔速度、、测序质量测序质量、、孔状态等孔状态等。。
              纳米孔测序的文库制备是将提取到的核酸进行修                          5 生物信息学分析
          复后连接测序接头的过程，如需同时测序多个样本，可                               生物信息学分析包括以下几个步骤：序列拆分、接
          在连接标签接头后再连接测序接头。不同连接方式使                            头及低质量序列过滤、数据统计、参考数据库比对及物
          用的试剂、时间、初始投入量均有所不同，需明确不同连                          种鉴定、背景微生物过滤、交叉污染判定、物种注释（物
          接方式的标准化操作步骤。不同应用方向的测序技术，                           种分类、致病性、临床意义）等。
          其建库方式不同，例如，tNGS要保证病原微生物的特异                         5.1 序列拆分
          性扩增或捕获效率；mNGS 更注重无偏倚扩增；WGS 则                           在构建测序文库时，每个样本会加上一个测序标签
          可在不打断核酸的情况下测序，纯菌液样本只需1 μg即                        （也称 barcode，一般为 24 bp 左右，属人工合成的序列片
          可直接进行WGS，而低起始量的样本可在扩增后进行，                          段），然后将多个样本批量混合上机（多份样本混合后加
          例如 COVID-19 在循环数阈值（Ct 值）仅为 35 时也可在                 入一张芯片），在测序后需通过识别测序标签以区分不
          扩增后进行WGS。                                          同样本。
              是否进行 PCR 扩增和片段化处理可根据起始核酸                       5.2 接头及低质量序列过滤
          含量和应用方向决定，以提高数据产出效率。扩增可能                               下机数据经拆分后即可得到每个样本的测序数据，
          会导致菌群或污染序列不成比例地扩大，对分析提出了                           但得到的测序数据需过滤掉测序接头和低质量序列（长
          更高的要求。建库完成后，应及时上机检测。因测序接                           度较短或平均测序质量较低的序列），然后将获得的高
          头含有蛋白成分，不宜用乙醇处理，也不宜长时间保存。                          质量读长序列作为微生物鉴定的输入数据。一般可使
          4.5 文库质量验证                                         用 Porechop 软件 过滤测序接头，使用 NanoFilt 、Filt‐
                                                                           [20]
                                                                                                       [21]
              各实验室应明确核酸质量及文库产出标准，不同建                         long（https：//github.com/rrwick/Filtlong）等工具过滤测序
          库方式应有不同的质量标准。可采用Qubit荧光染料法                         序列。可根据不同检测产品的片段读长特点选择合适
          检测文库浓度，高质量的文库需达到一定浓度。具体浓                           的最短读长阈值，平均测序质量值＜Q7 的序列将被整


          中国药房  2024年第35卷第14期                                              China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 14    · 1677 ·
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