Page 9 - 《中国药房》2024年14期

2 纳米孔测序简介 3 样本采集与运输保存
2.1 纳米孔测序的原理 3.1 样本采集
纳米孔测序是将单分子检测和电流信号传导相结 针对临床疑似感染性疾病的患者，可采集患者样本
合的测序方法，测序原理上摆脱了 NGS 的洗脱和 PCR 进行纳米孔测序。目前，该技术的灵敏度主要受样本中
扩增（边合成边测序）过程，通过连接接头的马达蛋白将 人源核酸占比、微生物含量以及微生物核酸提取效率的
双链核酸解开，在电场力的驱动下使单链核酸分子穿过 影响。为了保证检测效果，对感染性疾病的样本采集应
纳米蛋白孔道，由于不同的碱基通过纳米孔道时会产生 遵循以下基本原则：（1）尽量在患者入院当日或抗菌药
不同阻断程度的电流信号，测序仪通过记录电流信号的 物使用前采集样本；（2）尽量采集原发病灶部位的样本；
变化，就可推导出碱基信息，从而实现对核酸分子的测 （3）样本采集过程中应严格执行无菌操作；（4）从正常无
序 [1，9] 。相较于NGS，该技术实现了从短测序读长到超长 菌部位采集检测样本，应严格无菌操作，避免污染；（5）
测序读长、从光学检测到电子传导检测的双重跨越。 从有菌定植或污染部位采集样本，应采取必要措施，尽
2.2 纳米孔测序的特点 量减少污染。不同样本的采集方法如下 [16―17] ：
纳米孔测序具有以下特点：（1）可检测到的最长序 3.1.1 血液、骨髓及其他高凝样本
[9]
列达 4.2 Mb ，超长读长测序使得其在对同源性强的同 （1）血液样本通常于肘静脉采集3～5 mL血液至乙
二胺四乙酸（EDTA）抗凝管或游离 DNA 保存管中。采
属水平下的种水平鉴定特异性更高。由于可以跨过基
血时皮肤需彻底消毒，切忌在静脉滴注抗菌药物的静脉
因组的一些复杂区域，该技术可实现对复杂基因组的组
装和用于发现更多病原微生物的未知结构变异 [10―11] 。 处采血，除非怀疑有导管相关的血流感染。
（2）骨髓样本一般通过骨髓穿刺取得，临床医师需
（2）单孔测序平均速度可达 450 bp/s ，通过多通道纳米
[9]
要在严格无菌操作下，抽取患者 1～2 mL 骨髓样本至
孔并行测序，可以快速获得高通量待测序列。（3）建库过
EDTA抗凝管或游离DNA保存管中。
程无需片段化，可直接连接接头对核酸序列进行测序，
（3）其他高凝样本视样本类型规范采集，且采样管
简单便捷。（4）测序过程不依赖PCR扩增，避免了扩增给
需含有抗凝剂以避免发生血液凝固导致样本质量不合
测序带来的偏好性，可无偏倚地直接对原始 DNA 或
格。样本采集后应立即将采样管上下颠倒混匀 8～10
RNA进行测序，保留了原始碱基的修饰信息 [12―13] 。（5）可
次，以充分混匀血样与保护剂，避免样本凝固；混匀时应
实时进行碱基识别与分析，并能按需终止测序，显著缩
动作轻柔，以免发生溶血。
短了测序流程及分析时间，可满足动态检测需求。（6）纳
样本采集完成应立即拧紧管盖，标记条码后立即
米孔测序芯片经清洗后可反复使用，直至纳米孔蛋白失
送检。
活，因此上样更加灵活，有效提高了芯片利用率。（7）纳
3.1.2 呼吸道样本
米孔测序仪体积小巧、便携，不受电力、实验室空间和服
（1）咽拭子样本通常仅用于诊断上呼吸道感染。采
务器等外部资源的限制，适合床旁、野外或疫情暴发地
集时嘱患者张口发“啊”音，以暴露咽喉部，必要时用压
的实时测序 [14―15] 。
舌板；取出拭子管中的无菌长棉签，快速擦拭两侧腭弓
推
推荐意见荐意见1：：病原样本具有一定的生物安全隐患病原样本具有一定的生物安全隐患，，推推
和咽、扁桃体的分泌物，扁桃体有脓点时最好挤破脓点
荐
荐本地化开展病原微生物检测项目本地化开展病原微生物检测项目，，避免不当运输避免不当运输；；由由
并采集脓性物；将2～3根咽拭子存放在含有保存液的保
于纳米孔测序的灵活性纳米孔测序的灵活性，，取样后可即刻完成样本前处理取样后可即刻完成样本前处理
于 存管中，盖紧管盖，标记条码后立即送检。
及上机测序。。
及上机测序 （2）肺泡灌洗液是疑似肺炎或下呼吸道感染的最佳
推荐意见荐意见 2：：临床表现高度怀疑感染性疾病但病原临床表现高度怀疑感染性疾病但病原
推 送检样本。患者咽喉局部麻醉后，导入纤维支气管镜，
不明明，，需要快速识别感染性病原微生物需要快速识别感染性病原微生物，，但样本量较少但样本量较少
不 通过支气管镜对病灶所在支气管以下肺段或亚肺段进
使用用 NGS 开机成本高时开机成本高时，，推荐使用纳米孔测序推荐使用纳米孔测序。。纳米纳米
使 行多次灌洗，每次注入20～60 mL 37 ℃或室温无菌生理
孔测序上样更加灵活且可进行实时碱基识别与分析测序上样更加灵活且可进行实时碱基识别与分析，，能能
孔 盐水，通常灌洗4～5次，负压吸引回收，回收液中一般会
够实现感染性病原微生物检测时效性与成本的平衡 包含约10 mL支气管末梢和肺泡中的分泌物；弃去首管
够实现感染性病原微生物检测时效性与成本的平衡。。
推 可能被污染的样本，收集第二管，标记条码后立即送检。
推荐意见荐意见3：：针对新发突发传染病疫情防控针对新发突发传染病疫情防控，，需要基需要基
于全长基因组进行病原微生物演化和变异分析时全长基因组进行病原微生物演化和变异分析时，，推荐推荐 （3）痰样本主要用于下呼吸道感染的辅助诊断。在
于
使用较长读长的纳米孔测序进行病原微生物全长基因用较长读长的纳米孔测序进行病原微生物全长基因 医护人员的指导下，患者需用清水或生理盐水漱口2～3
使
组检测和分子溯源。。 次，有假牙者应先取下假牙，再用力咳出深部痰液 3～5
组检测和分子溯源
推荐意见荐意见 4：：对于需要区分高同源性的病原微生物对于需要区分高同源性的病原微生物
推 mL于无菌杯内，勿留取唾液和鼻咽腔分泌物；若无法自
亚型型（（例如结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌例如结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌））时时，，推荐使推荐使
亚 行咳痰，可通过吸痰器从气道采集；盖好并拧紧杯盖，标
用较长读长的纳米孔测序以增加其特异性。。
用较长读长的纳米孔测序以增加其特异性 记条码后立即送检。
中国药房 2024年第35卷第14期 China Pharmacy 2024 Vol. 35 No. 14 · 1675 ·