Page 58 - 《中国药房》2024年13期

2.3 大鼠PWL检测 表1 引物设计与扩增产物长度
PWT检测完毕10 min后，采用局部热刺痛的方式检 基因名称 引物序列（5′→3′） 扩增产物长度/bp
测大鼠足底的 PWL，具体操作如下：设定热刺痛仪的温 cGAS 上游引物：AGGAAGGAGCCAGACAAGC 211
下游引物：CATCAAATTCATTAGGAGCAGA
度为 55 ℃，待大鼠适应后（静止时）将热刺痛源置于其 STING 上游引物：AGAATCCGAAGAGGGAAAC 127
后足脚掌，记录大鼠后肢缩起或出现舔足的时间，即为 下游引物：CAGTAGGGAGGGACGAGGT
PWL（s）。若超过40 s无反应则停止刺激，结果按40 s计。 β-actin 上游引物：ACATCCGTAAAGACCTCTATGCC 223
下游引物：TACTCCTGCTTGCTGATCCAC
2.4 大鼠坐骨神经病理学改变观察
2.9 大鼠坐骨神经中cGAS、STING蛋白表达检测
采用HE染色法进行观察。PWL与PWT检测完后，
脱颈处死所有大鼠。解剖分离大鼠的左侧坐骨神经。 采用Western blot法进行检测。取“2.4”项下剩余的
随机选取6只大鼠的坐骨神经组织（剩余大鼠的坐骨神 冻存坐骨神经，用 RIPA 裂解液提取组织总蛋白。采用
经组织进行冻存），经多聚甲醛固定后制备组织切片（厚 BCA 法测定蛋白浓度，蛋白经变性后，进行 12% 十二烷
度16 μm）。经常规HE染色后，在光镜下观察大鼠坐骨 基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（电压100 V，电泳时间3
神经组织的病理学变化，并对病理学改变进行评分：0 h）分离并转膜（电压100 V，转膜时间1～2 h），然后用牛
分——神经细胞结构正常，无损伤；1分——有少量神经 血清白蛋白封闭 2 h；滴加 cGAS、STING、GAPDH 一抗
纤维的轴突或髓鞘损伤，损伤面积＜2%；2分——有部分神 稀释液（稀释比例均为 1∶1 000），4 ℃下孵育过夜；洗膜
经纤维的轴突或髓鞘损伤，损伤面积为2%～5%；3分—— 后，加入相应二抗，常温孵育2 h。使用ECL发光液进行
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有明显的神经纤维轴突或髓鞘损伤，损伤面积＞5% 。 显影，凝胶图像处理系统分析目标蛋白的灰度值，以目
2.5 大鼠坐骨神经元形态观察 标蛋白与内参蛋白（GAPDH）条带的灰度值比值作为目
采用尼氏染色法进行观察。取“2.4”项下每组剩余 标蛋白的表达水平。
的部分坐骨神经冰冻切片，经乙醇梯度脱水后，放入尼 2.10 统计学方法
氏染色液中浸染 25 min，再次乙醇脱水后二甲苯透明、 采用 GraphPad Prism 7.0 软件进行统计分析。计量
封片。在显微镜下观察大鼠坐骨神经元的形态，并使用 资料以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一
Image-Pro plus 图像处理软件计数 5 个不同视野的尼氏 步组间两两比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。
体数量，取平均值。 3 结果
2.6 大鼠坐骨神经中小胶质细胞数检测 3.1 TP对大鼠PWT、PWL的影响
采用免疫荧光染色法进行检测。取“2.5”项下每组
如表 2 所示，与 Sham 组比较，Model 组大鼠 PWT、
用剩的坐骨神经切片，用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗、Tri‐ PWL 均显著降低/缩短（P＜0.05）。与 Model 组比较，吲
ton 渗透，并用牛血清蛋白封闭后，加入 IBA1（稀释比例
哚美辛组、TP-L 组、TP-H 组大鼠 PWT、PWL 均显著增
1∶100）抗体在4 ℃下孵育过夜。之后加入相应二抗，室
加/延长（P＜0.05），且 TP 的作用具有剂量依赖性（P＜
温孵育2 h，在荧光显微镜下观察切片，染成红色的细胞
0.05）。与 TP-H 组比较，TP-H+DMXAA 组大鼠 PWT、
为阳性细胞（即为IBA1蛋白标记的小胶质细胞）。采用
PWL均显著降低/缩短（P＜0.05）。
Image J软件对阳性细胞进行计数。
表2 各组大鼠PWT、PWL的比较（x±s，n＝12）
2.7 大鼠坐骨神经中IL-1β、TNF-α水平检测
组别 PWT/g PWL/s
采用 ELISA 法进行检测。取“2.4”项下冻存的部分 Sham组 9.87±1.04 14.57±1.24
坐骨神经，在冰上制备组织悬液。取部分组织悬液，根 Model组 3.20±0.40 a 6.02±0.51 a
据IL-1β、TNF-α ELISA试剂盒说明书操作，分别检测大 吲哚美辛组 7.92±0.66 b 11.30±1.05 b
TP-L组 5.84±0.32 b 8.73±0.58 b
鼠坐骨神经中IL-1β、TNF-α水平。
TP-H组 8.86±0.73 bc 12.79±1.10 bc
2.8 大鼠坐骨神经中cGAS、STING mRNA表达检测 TP-H+DMXAA组 4.38±0.47 d 7.53±0.56 d
采用 RT-qPCR 法进行检测。取“2.7”项下每组剩余 a：与Sham组比较，P＜0.05；b：与Model组比较，P＜0.05；c：与TP-L
的坐骨神经组织悬液，加入 Trizol 试剂提取总 RNA，采 组比较，P＜0.05；d：与TP-H组比较，P＜0.05。
用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，并以cDNA为 3.2 TP对大鼠坐骨神经病理学改变的影响
模板进行PCR扩增。PCR扩增条件如下：95 ℃预变性5 如图1、表3所示，Sham组大鼠坐骨神经的髓鞘分布
min；95 ℃变性 1 min，60 ℃扩增/延伸 40 s，循环 40 次； 均匀，结构完整，神经纤维排列紧密有序，轴突具有良好
72 ℃再延伸 2 min，结束反应。引物序列由生工生物工 的连续性。Model组大鼠的坐骨神经髓鞘、轴突、神经纤
程（上海）股份有限公司设计并合成，详见表 1。以 维等均发生不同程度的形状改变，髓鞘和轴突几乎不可
β-actin为内参，采用2 －ΔΔCt 法计算大鼠坐骨神经中cGAS、 见，神经纤维结构不规则，排列疏松，坐骨神经病理学评
STING mRNA的相对表达量。 分较 Sham 组显著升高（P＜0.05）。与 Model 组比较，吲

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