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研磨，然后于 4 ℃下以 12 000 r/min 离心 15 min，取上清             表1 各组小鼠血清中 ALT、AST 水平测定结果（x±s，
          液以相同条件再次离心，使用 BCA 蛋白检测试剂盒对                               n＝6，U/L）
          上清液中总蛋白进行定量。将蛋白变性处理后，进行十                            组别                   ALT              AST
          二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质（电压                            NC组                5.52±1.19        37.41±7.93
                                                              CCl 4组             13.83±1.79 a     87.07±23.82 a
          80 V，电泳时间 30 min；电压 120 V，电泳时间 60 min），
                                                              BP-L组              8.97±3.55 b      36.24±6.79 b
          然后电转（电流80 V，转膜时间90 min）至聚偏二氟乙烯                      BP-H组              6.30±2.65 b      33.80±8.33 b
          膜上，用 5% 牛血清白蛋白在常温条件下封闭 1.5 h。加                         a：与NC组比较，P＜0.05；b：与CCl 4组比较，P＜0.05。
          入相应一抗（α-SMA、GAPDH 的稀释度均为 1∶5 000，                   3.2 BP对肝纤维化小鼠肝组织病理形态学的影响
          Collagen Ⅰ的稀释度为 1∶2 000），在 4 ℃下孵育过夜。                    HE 染色结果显示，NC 组小鼠肝细胞排列整齐，细
          TBST 洗膜后，加入二抗（稀释度为 1∶8 000），于室温孵                    胞界限清晰，细胞核无明显核固缩和核破裂溶解现象；
          育 1 h；TBST 洗膜后，滴加显色液，应用成像系统显影。
                                                              与NC组比较，CCl4组小鼠肝组织细胞排列紊乱，细胞界
          应用 Image J 软件分析条带灰度值，以目的蛋白与内参
                                                              限模糊，出现明显的核固缩和核破裂溶解现象；与 CCl4
          蛋白（GAPDH）条带的灰度值比值表示目的蛋白的表达
                                                              组比较，BP-L 组和 BP-H 组小鼠肝组织细胞较为整齐，
          水平。                                                 细胞界限清楚，细胞核固缩和核破裂溶解情况改善，其
          2.6 小鼠血清代谢组学研究
                                                              中以 BP-H 组小鼠的改善作为更显著。肝组织 Masson
              基于药效学结果发现，高剂量 BP 对于肝纤维化的                        和Sirius Red染色结果显示，NC组小鼠无明显胶原纤维
          改善作用较好，遂本研究选取 NC 组、CCl4组和 BP-H 组
                                                              染色，无假小叶形成；与 NC 组比较，CCl4组小鼠肝组织
          小鼠的血清进行代谢组学分析。每只小鼠取 100 μL血
                                                              有明显胶原纤维染色和假小叶形成，Masson染色阳性面
          清置于1.5 mL EP管中，加入400 μL乙腈-甲醇（1∶1，V/V）
                                                              积比、Sirius Red染色阳性面积比均显著升高（P＜0.05）；
          溶液，涡旋 30 s，放置在－20 ℃冰箱中 1 h 后取出，在
                                                              与CCl4组比较，BP-L组和BP-H组小鼠肝组织胶原纤维
          4 ℃下以 12 000 r/min 离心 15 min，取上清，氮气挥干。              染色和假小叶形成明显减少，Masson 染色阳性面积比、
          加入 100 μL 乙腈-水（1∶1，V/V）溶液复溶，涡旋 30 s，在
                                                              Sirius Red 染色阳性面积比均显著降低（P＜0.05），其中
          4 ℃下以 12 000 r/min 离心 15 min，取上清液于进样瓶
          中。每个样品取 5 μL 上清液混合成质量控制（quality                     以BP-H组小鼠的改善作用更明显。结果见图1、表2。
                                                              3.3 BP对肝纤维化小鼠肝组织中纤维化相关蛋白表达
          control，QC）样品，每隔 10 个样本插入 1 个 QC 样品，进
                                                              的影响
                                 TM
                [9]
          行分析 。采用Triple Quad  5500型液质联用系统进行
                                                              3.3.1 免疫组化检测结果
          检测，离子对信息来源于美国AB SCIEX公司。
                                                                  与NC组[阳性面积比为（1.59±0.74）%，n＝6]比较，
              将得到的数据导入 Metaboanalyst 6.0 平台（https：//
          www.metaboanalyst.ca）进行分析，组间差异部分利用偏                 CCl4组小鼠肝组织中 α-SMA 蛋白表达[阳性面积比为
                                                             （3.08±1.17）%，n＝6]显著增强（P＜0.05）；与 CCl4组比
          最小二乘-判别分析法（partial least squares discriminant
          analysis，PLS-DA）和正交偏最小二乘-判别分析法（or‐                  较，BP-L 组和 BP-H 组小鼠肝组织中 α-SMA 蛋白表达
          thogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-  [阳性面积比分别为（1.28±0.50）%、（0.99±0.50）%，n＝
          DA）分析呈现；绘制火山图，以Fold Change≥1.5或Fold                 6]均显著减弱（P＜0.05）。结果见图2。
          Change≤0.8，且 P＜0.05 筛选血清差异代谢物；利用京                   3.3.2 Western blot检测结果
          都基因和基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes                 与NC组比较，CCl4组小鼠肝组织中α-SMA、Collagen Ⅰ
          and genomes，KEGG）进行通路富集分析，以 P＜0.05 为                蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05）；与 CCl4 组比较，
                              [10]
          阈值筛选差异代谢途径 。                                        BP-L组和BP-H组小鼠肝组织中α-SMA、Collagen Ⅰ蛋白
          2.7 统计学方法                                           表达水平均显著降低（P＜0.05）。结果见图3、表3。
              采用GraphPad Prism 8软件进行统计分析和图表绘                  3.4 代谢组学研究结果
          制。符合正态分布的计量资料以x±s表示，多组间比较                           3.4.1 BP对肝纤维化小鼠血清代谢物的影响
          采用单因素方差分析，方差齐性时组间两两比较选择                                 PLS-DA 结果（图 4）显示，NC 组、CCl4组和 BP-H 组
          LSD 检验，方差不齐时组间两两比较则采用 Tamhane’s                     3 组样品分离明显，说明各组间代谢物有明显差异。
                                                                                                      2
          T2检验。检验水准α＝0.05。                                    OPLS-DA 结果（图 5）显示，NC 组与 CCl4组的 R Y（表示
          3 结果                                                模型的解释率，数值越接近于1表示模型的差异性越大）
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          3.1 BP对肝纤维化小鼠肝功能指标的影响                               和 Q（表示模型的预测能力，数值越接近于 1 表示模型
              与NC组比较，CCl4组小鼠血清中ALT、AST水平均                     的可靠性越强）分别为0.968、0.715，CCl4组与BP-H组的
                                                               2
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          显著升高（P＜0.05）；与CCl4组比较，BP-L组、BP-H组小                  R Y和Q 分别为0.998、0.833，所有的OPLS-DA模型无过
          鼠血清中 ALT、AST 水平均显著降低（P＜0.05）。结果                     度拟合。火山图（图 6）显示，NC 组和 CCl4组共有 36 个
          见表1。                                                血清差异代谢物，其中 16 个物质上调，20 个物质下调；


          · 1572 ·    China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 13                            中国药房  2024年第35卷第13期
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