Page 33 - 《中国药房》2024年13期
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          不加以控制，最终会引起肝硬化乃至肝癌 。虽然关于                           境温度（22±1） ℃、12 h光照/12 h黑暗循环的环境中，适
          肝纤维化治疗的药理研究较多，但临床上尚无特异、有                           应性喂养1周后开始造模给药。本研究经深圳华腾生物
          效的肝纤维化治疗方法，主要还是通过保肝类药物（如                           科技有限公司实验动物使用与管理委员会批准，伦理批
          水飞蓟素、奥贝胆酸等）缓解肝损伤和肝脏炎症来改善                           件编号为B202308-3。
          症状。但水飞蓟素会导致腹泻，奥贝胆酸会引起皮肤瘙                           2 方法
                                      [2]
          痒和甲状腺功能异常等不良反应 。因此，开发有效且                           2.1 动物分组、造模与给药
          安全的肝纤维化治疗药物具有重要意义。                                     将 40 只小鼠按体重随机分成 4 组，即正常对照组
              佛手柑内酯（bergapten，BP）又名 5-甲氧基补骨脂                （NC组）、模型组（CCl4组）和BP低、高剂量组（BP-L、BP-
          素，是中国传统的药食两用植物佛手中的一种呋喃香豆                           H组），每组10只。CCl4组、BP-L组、BP-H组小鼠腹腔注
                  [3]
          素类成分 ，具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化等多种药理活                           射含 10%CCl4的橄榄油溶液（0.5 mL/kg），NC 组小鼠腹
          性 [4―5] 。既往研究表明，BP 能够减轻对乙酰氨基酚诱导                    腔注射等量橄榄油溶液，每周注射 2 次，持续 8 周 。根
                                                                                                       [7]
                        [6]
          的药物性肝损伤 ，提示其有一定的保肝作用，但 BP 对                        据以往报道      [6，8] ，BP 的小鼠灌胃剂量为 30～100 mg/kg，
          肝纤维化的治疗效果和机制还鲜有报道。由于代谢组                            鉴于 BP 确切的疗效和较低的毒性，本研究采用 50、100
          学已广泛应用于挖掘肝纤维化的发病机制，因此本研究
                                                             mg/kg 为低、高剂量进行给药。BP-L、BP-H 组小鼠自首
          采用四氯化碳（CCl4 ）诱导并制备肝纤维化小鼠模型，以
                                                             次腹腔注射含 10%CCl4的橄榄油溶液后的第 2 日起，每
          此来评价 BP 改善肝纤维化的效果，并采用广泛靶向代
                                                             天早上灌胃相应剂量 BP（以 0.5% 羧甲基纤维素钠溶液
          谢组学技术探讨BP对肝纤维化小鼠血清中差异代谢物
                                                             作为溶剂）1次，持续8周；NC组和CCl4组小鼠灌胃等体
          的影响，初步探究BP改善肝纤维化的作用机制，以期为                          积的0.5%羧甲基纤维素钠溶液。
          BP用于肝纤维化的防治提供理论基础。                                 2.2 样本采集及处理
          1 材料
                                                                 每周一的早上记录小鼠体重。末次给药后，小鼠禁
          1.1 主要仪器
                                                             食不禁水12 h。24 h后，麻醉小鼠并眼球取血，然后颈椎
              本研究所用的主要仪器有KF-PRO-020型数字病理
                                                             脱臼处死小鼠，取出小鼠肝组织，将一部分肝组织置于
          切片扫描仪（宁波江丰生物信息技术有限公司）、Tanon                        4% 多聚甲醛中固定，剩余肝组织分装后置于－80 ℃冰
          5200型全自动化学发光图像分析系统（上海天能生命科
                                                             箱中冻存。小鼠全血室温静置分离30 min后，在4 ℃下
          学生物有限公司）、QuantStudio 6 型实时荧光定量聚合                   以3 000 r/min离心15 min，收集上层血清，置于－80 ℃冰
          酶链式反应（PCR）仪（美国 Thermo Fisher Scientific 公
                                                             箱中冻存，备用。
          司）、Mini-PROTEAN 型垂直电泳装置（美国 Bio-Rad 公
                                                             2.3 肝功能指标检测
                       TM
          司）、Triple Quad  5500型液质联用系统（美国AB Sciex
                                                                 每组随机选取6只小鼠的血清，分别按照ALT、AST
          公司）等。
                                                             试剂盒说明书操作，检测小鼠血清中ALT、AST水平。
          1.2 主要药品与试剂
              BP 对照品（批号 155600，纯度 99.95%）购自上海陶               2.4 肝组织病理形态学观察
                                                                 取经 4% 多聚甲醛固定 24 h 的肝组织适量，以梯度
          术生物科技有限公司；BCA 蛋白检测试剂盒（批号
                                                             乙醇脱水后，在室温条件下以二甲苯溶液Ⅰ、Ⅱ分别浸
          060823240207）购自上海碧云天生物技术股份有限公
          司；鼠源甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phos‐             泡10 min，常规制备石蜡切片（厚度3 μm）。随机选取6
          phate  dehydrogenase，GAPDH）单 克 隆 抗 体（ 批 号          只小鼠的肝组织石蜡切片，分别采用苏木素-伊红（HE）、
          62u0922）购自江苏亲科生物研究中心有限公司；兔源α-                      Sirius Red和Masson三色染色法进行染色。采用光学显
          平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、重组            微镜观察肝组织病理形态学变化，然后分别使用Image J
          Ⅰ型胶原蛋白（Collagen Ⅰ）单克隆抗体（批号分别为                      软件分析 Sirius Red 染色和 Masson 染色的胶原阳性面
          1000229-3、1002394-4）均购自英国 Abcam 公司；丙氨酸             积比（胶原阳性面积与总面积的比值）。Sirius Red阳性
          转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸转氨           染色呈红色，Masson阳性染色呈蓝色。
          酶（aspartate aminotransferase，AST）试剂盒（批号分别为         2.5 肝组织中纤维化相关蛋白表达检测
          20230925、20230923）均购自南京建成生物工程研究所                   2.5.1 免疫组化法检测α-SMA蛋白表达
          有限公司；甲醇、乙腈为色谱纯，水为超纯水。                                  取“2.4”项下制备的小鼠肝组织石蜡切片，采用
          1.3 动物                                             α-SMA 一抗（稀释比例 1∶1 000）进行染色，烘干后室温
              本研究所用动物为 SPF 级 C57BL/6 小鼠，共 40 只，              干燥保存，随后使用光学显微镜观察肝组织中 α-SMA
          雄性，8 周龄，体重 18～22 g，购自珠海百试通生物科技                     的表达情况（阳性染色呈棕褐色），并用 Image J 软件分
          有限公司，动物生产许可证号为 SCXK（粤）2020-0051。                   析阳性面积比（阳性面积与总面积的比值）。
          所有小鼠均饲养于深圳市华腾生物科技有限公司，动物                           2.5.2 Western blot法检测α-SMA、Collagen Ⅰ蛋白表达
          使用许可证号为 SYXK（粤）2023-0327。小鼠饲养在环                        取适量冻存的肝组织，加入研磨珠和 RIPA 裂解液


          中国药房  2024年第35卷第13期                                              China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 13    · 1571 ·
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