Page 28 - 《中国药房》2024年13期
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鼠除灌胃 40 mg/kg FMN 外，还需腹腔注射 10 mg/kg                 caspase-3、Bax、Bcl-2、GAPDH 一 抗（稀 释 比 例 均 为
                                 [9]
          VTPF（以生理盐水为溶剂） ；IBD组、Normal组大鼠每天                    1∶1 000），4 ℃孵育过夜；洗膜后，加入相应山羊抗兔IgG
          灌胃并腹腔注射等体积的生理盐水。每天1次，连续7 d。                         二抗（稀释比例1∶5 000），室温孵育2 h；洗膜后，利用化
          2.3 大鼠一般情况观察及疾病活动指数评分                               学发光法显色，使用凝胶图像处理系统分析蛋白灰度
              末次给药 24 h 后，观察各组大鼠的一般情况、体重                      值。以目标蛋白与内参蛋白（GAPDH）条带灰度值的比
          变化、大便情况以及肛周污染等，并对大鼠疾病活动指                            值表示目标蛋白的表达水平。
          数（disease activity index，DAI）进行评分。DAI的评分标           2.9 统计学方法
          准如下：1 分——体重下降 1%～5%，大便松散、隐血阳                            采用 GraphPad Prism 7.0 软件对数据进行统计分
          性；2 分——体重下降 6%～10%，大便松散、隐血阳性；                       析。实验数据以x±s表示，多组间比较采用单因素方差
          3 分——体重下降 11%～15%，大便松散、隐血阳性；4                       分析，组间两两比较行LSD-t检验。检验水准α＝0.05。
          分——体重下降＞15%，出现稀便、肉眼可见血便。DAI                         3 结果
                                           [4]
          评分越高，说明大鼠的IBD病情越严重 。                                3.1 FMN对大鼠一般情况及DAI评分的影响
          2.4 取材及大鼠结肠长度测量                                         Normal组大鼠好动，毛发有光泽，食欲良好，大便正
              DAI评分完成后，使用戊巴比妥钠将大鼠麻醉后进                         常；IBD组大鼠精神萎靡，懒动，毛发无光泽，食欲下降，
          行腹主动脉取血，离心收集血清并进行分装。取血后脱                            出现稀便、血便或隐血阳性；FMN-L 组、FMN-H 组大鼠
          颈处死大鼠，解剖取其结肠组织。每组选取6只大鼠，对                           精神、食欲逐渐恢复正常，毛发变得有光泽，大便也趋于
          其结肠的长度进行测量，之后冻存于－80 ℃冰箱中；将                          正常，偶有稀便；FMN-H+VTPF 组大鼠的精神、食欲状
          每组剩余 6 只大鼠的结肠组织浸泡于多聚甲醛中进行                           态略差，毛发变得粗糙。与 Normal 组比较，IBD 组大鼠
          固定。                                                 DAI 评分显著升高（P＜0.05）。与 IBD 组比较，FMN-L
          2.5 大鼠结肠组织病理学变化观察                                   组、FMN-H 组大鼠 DAI 评分均显著降低（P＜0.05），且
              取固定于多聚甲醛中的各组大鼠结肠组织适量，进                          FMN 的作用具有剂量依赖性（P＜0.05）。与 FMN-H 组
          行常规石蜡包埋、切片（厚4 μm）后，行常规HE染色，然                        比较，FMN-H+VTPF 组大鼠 DAI 评分显著升高（P＜
          后在光镜下观察其病理学变化。                                      0.05）。DAI评分结果见表1。
          2.6 大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-10水平检测                          表1 各组大鼠DAI评分和结肠长度比较（x±s）
              采用ELISA法检测。取大鼠血清，根据ELISA试剂                      组别                 DAI评分（n＝12）/分    结肠长度（n＝6）/cm
          盒说明书进行操作，使用酶标仪检测各组大鼠血清中                             Normal组              0.12±0.02        11.24±0.82
          TNF-α、IL-6、IL-10水平。                                 IBD组                 3.65±0.24 a      7.70±0.63 a
                                                              FMN-L组               2.42±0.19 b      8.94±0.77 b
          2.7 大鼠肠上皮细胞的凋亡情况检测                                  FMN-H组               1.23±0.15 bc     10.50±0.89 bc
              采用TUNEL染色法检测。将“2.5”项下结肠组织切                      FMN-H+VTPF组          2.27±0.26 d      8.73±0.80 d
          片进行脱蜡和水化后，按照 TUNEL 试剂盒方法进行操                            a：与Normal组比较，P＜0.05；b：与IBD组比较，P＜0.05；c：与
          作和相关染色。在荧光显微镜下随机选取6个视野进行                            FMN-L组比较，P＜0.05；d：与FMN-H组比较，P＜0.05。
          观察，阳性凋亡细胞呈绿色荧光，细胞核呈蓝色荧光。                            3.2 FMN对大鼠结肠长度的影响
          计算各组大鼠肠上皮细胞的凋亡率：凋亡率＝阳性凋亡                                与 Normal 组比较，IBD 组大鼠结肠长度显著变短
          细胞数/总细胞数×100%。结果以6个视野凋亡率的均                         （P＜0.05）。与 IBD 组比较，FMN-L 组、FMN-H 组大鼠
          值表示。                                                结肠长度均显著增长（P＜0.05），且 FMN 的作用具有剂
          2.8 大鼠结肠组织中Hippo/YAP信号通路相关蛋白与                       量依赖性（P＜0.05）。与FMN-H组比较，FMN-H+VTPF
          凋亡相关蛋白表达检测                                          组大鼠结肠长度显著变短（P＜0.05）。结果见表1、图1。
              采用 Western blot 法检测。取冻存的大鼠结肠组                   3.3 FMN对大鼠结肠组织病理学变化的影响
          织，加入 RIPA 裂解液提取组织中总蛋白。采用 BCA 法                          Normal 组大鼠结肠组织细胞形态正常、排列整齐，
          进行蛋白定量、热变性后，进行12%十二烷基硫酸钠-聚                          肠黏膜结构正常，未见溃疡、炎症细胞浸润。IBD 组大
          丙烯酰胺凝胶电泳（电压200 V，电泳时间45 min）分离，                     鼠结肠组织细胞形态异常、排列紊乱，出现水肿、溃疡、
          将蛋白转膜（电流200 mA，转膜时间40 min）至聚偏二氟                     出血现象，有大量的炎症细胞浸润。FMN-L组、FMN-H
          乙烯膜上，以 5% 脱脂奶粉封闭 2 h；加入 YAP、cleaved-                组大鼠的结肠组织溃疡和水肿减轻，炎症细胞浸润减


                            1 cm                1 cm                1 cm                 1 cm              1 cm
                A. Normal组           B. IBD组             C. FMN-L组           D. FMN-H组         E. FMN-H+VTPF组
                                              图1 各组大鼠结肠外观示例图


          · 1566 ·    China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 13                            中国药房  2024年第35卷第13期
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