Page 89 - 《中国药房》2024年12期
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2.2 大鼠一般情况观察及血清肾功能指标检测                             相应二抗（稀释比例为 1∶200），于室温下孵育 1 h；以
              实验期间，观察各组大鼠饮食、排便、毛发密集程度                        ECL发光试剂显影后，置于凝胶成像系统下成像。使用
          及光泽度、精神状态等一般情况。末次给药次日，采集                           Image J软件分析蛋白条带的灰度值，以目的蛋白与内参
          各组大鼠眶静脉血，于 4 ℃下离心 10 min，收集上层血                     蛋白的灰度值比值表示目的蛋白的表达水平。
          清，根据相应 ELISA 试剂盒说明书操作，使用酶标仪检                       2.8 统计学方法
          测其BUN、Scr、UA水平。                                        采用SPSS 20.0软件对数据进行统计分析。符合正
          2.3 大鼠肾组织病理学检查                                     态分布的实验数据以x±s表示，多组间比较采用单因素
              采血后，随机选取各组 5 只大鼠，麻醉后处死，分离                      方差分析，进一步两两比较采用 LSD-t 检验。检验水准
          肾脏，取肾组织适量用 4% 多聚甲醛固定，经石蜡包埋、                        α＝0.05。
          切片、苏木精-伊红（HE）染色后，置于光学显微镜下观察                        3 结果
          其肾组织病理学变化并拍照。                                      3.1 PA对CRF大鼠一般情况的影响
          2.4 大鼠肾小管损伤和肾纤维化观察                                     Sham 组大鼠饮食、排便正常，毛发密集且鲜亮，体
              取“2.3”项下各组大鼠的肾组织切片，经乙醇梯度脱                      型丰满，精神状态良好；与 Sham 组比较，CRF 组大鼠饮
          水后，进行Masson染色，置于光学显微镜下观察其肾小                        食减少，尿少、便稀，毛发枯乱，体型瘦小，精神萎靡且反
          管损伤和肾纤维化情况。根据肾小管扩张和坏死程度                            应迟钝；与CRF组比较，PA各剂量组大鼠的上述情况均
          进行肾小管损伤评分，具体标准为：无扩张或坏死，记 0                         有所改善，但仍不如 Sham 组；与 PA-H 组比较，PA-H+
          分；肾皮质-肾髓质区损伤百分比＜25%，记1分；肾皮质-                       LPA组大鼠的上述情况加重，但较CRF组有所减轻。
          肾髓质区损伤百分比为 25%～＜50%，记 2 分；肾皮质-
                                                             3.2 PA对CRF大鼠肾功能指标的影响
          髓质区损伤百分比为 50%～75%，记 3 分；肾皮质-髓质
                                                                 与 Sham 组比较，CRF 组大鼠血清 BUN、Scr、UA 水
          区损伤百分比＞75%，记 4 分 。同时，使用 Image Pro
                                   [9]
                                                             平均显著升高（P＜0.05）；与 CRF 组比较，PA 各剂量组
          Plus 6.0软件量化纤维化区域（呈蓝色）面积与组织切片
                                                             大鼠血清BUN、Scr、UA水平均显著降低，且呈剂量依赖
          总面积的百分比（简称“肾纤维化面积占比”）。
                                                             性（P＜0.05）；与PA-H组比较，PA-H+LPA组大鼠血清上
          2.5 大鼠肾组织氧化应激及炎症指标检测
                                                             述指标水平均显著升高（P＜0.05）。结果见表1。
              采血后，随机选取各组另 5 只大鼠，麻醉后处死，分
                                                             表1 PA对CRF大鼠血清肾功能指标的影响（x±s，n＝
          离肾脏，取肾组织适量制备匀浆，离心后分离上清，根据
                                                                  15）
          相应 ELISA 试剂盒说明书操作，使用酶标仪检测其
                                                              组别          BUN/（mmol/L）  Scr/（μmol/L）  UA/（μmol/L）
          MDA、SOD、TNF-α、IL-1β、IL-6水平。                         Sham组        7.82±0.92    54.91±7.67  47.43±6.02
          2.6 大鼠肾组织中CTGF、collagen Ⅰ表达检测                       CRF组        26.78±2.86 a  164.23±19.59 a  121.42±11.43 a
              采用免疫荧光法检测。采血后，随机选取各组剩余                          PA-L组       23.21±3.14 b  135.76±17.28 b  106.39±9.46 b
                                                              PA-M组       17.92±2.18 bc  104.38±12.61 bc  83.42±6.74 bc
          5 只大鼠，麻醉后处死，分离肾脏，取肾组织适量以液氮
                                                              PA-H组       13.43±1.52 bcd  77.62±6.67 bcd  54.26±3.89 bcd
          快速冷冻、固定后，使用3%过氧化氢阻断内源性过氧化                           PA-H+LPA组   15.69±1.94 e  94.83±10.71 e  76.13±5.64 e
          物酶，然后用牛血清白蛋白封闭、孵育；加入 CTGF、col‐                        a：与Sham组比较，P＜0.05；b：与CRF组比较，P＜0.05；c：与PA-L
          lagen Ⅰ一抗（稀释比例均为 1∶200），于 4 ℃下孵育过                  组比较，P＜0.05；d：与PA-M组比较，P＜0.05；e：与PA-H组比较，P＜
          夜；加入相应二抗（稀释比例为1∶600），于室温下孵育1                       0.05。
          h；以4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）复染，置于共聚焦                   3.3 PA对CRF大鼠肾组织病理学变化的影响
          显微镜下观察并拍照，按下式计算 CTGF、collagen Ⅰ阳                       与Sham组比较，CRF组大鼠的肾小球数量减少，囊
          性表达率：阳性表达率＝阳性表达细胞（呈绿色）数/细胞                         腔扩大，肾小管扩张且结构杂乱不清晰，间质内有大量
          总数×100%。                                           炎症细胞浸润；与CRF组比较，PA各剂量组大鼠肾小球
          2.7 大鼠肾组织中信号通路及纤维化相关蛋白表达                           病变和肾小管扩张程度均有所减轻，管状结构清晰且排
          检测                                                 列整齐，间质内炎症细胞浸润减少；与PA-H组比较，PA-
              采用Western blot法检测。取“2.6”项下各组大鼠剩                H+LPA组大鼠肾组织病变加重。结果见图1。
          余的肾组织，以RIPA缓冲液裂解以提取总蛋白，以BCA                        3.4 PA对CRF大鼠肾小管损伤和肾纤维化的影响
          法进行蛋白定量后加热变性。取变性蛋白适量，进行                                与 Sham 组比较，CRF 组大鼠肾小管损伤评分和肾
          10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并转移                          纤维化面积占比均显著升高或增大（P＜0.05）；与 CRF
          到聚偏二氟乙烯膜上，用5%脱脂牛奶封闭1 h；洗膜后，                        组比较，PA 各剂量组大鼠肾小管损伤评分和肾纤维化
          加入通路相关蛋白（RhoA、ROCK1）、纤维化相关蛋白                       面积占比均显著降低，且呈剂量依赖性（P＜0.05）；与
         （TGF-β1、NKD2、α-SMA）、内参蛋白（GAPDH）一抗（稀                 PA-H 组比较，PA-H+LPA 组大鼠上述指标均显著升高
          释比例均为1∶1 000），于4 ℃下孵育过夜；洗膜后，加入                    （P＜0.05）。结果见图2、表2。


          中国药房  2024年第35卷第12期                                              China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 12    · 1491 ·
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