Page 59 - 《中国药房》2024年12期
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细胞分别加入含 25 mmol/L 葡萄糖+2 μmol/L 吴茱萸碱                µL、PCR反向引物（10 µmol/L）0.8 µL、cDNA（200 ng/μL）
          或含25 mmol/L葡萄糖+4 μmol/L吴茱萸碱的DMEM完                  2 µL 和无菌水 6.4 µL。PCR 反应条件为：94 ℃预变性 5
          全培养基（吴茱萸浓度参考本课题组前期预实验和相关                           min；94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共
          文献 设置）；pc-NC 组和 pc-RAGE 组细胞分别使用                    40 个循环。以 GAPDH 为内参，采用 2          －ΔΔCt 法分析 AGE、
              [11]
          Lipofectamine 2000 转染试剂转染 pc-NC 和 pc-RAGE 质        RAGE、NF-κB p65、MMP-2、MMP-9 mRNA 的表达水
          粒（经 qRT-PCR 法检测，若 pc-RAGE 组细胞中 RAGE                平，结果以对照组为参照进行归一化处理。PCR引物序
          mRNA表达较吴茱萸碱高浓度组和pc-NC组显著升高，                        列及产物长度见表1。
          则提示转染成功），再加入含25 mmol/L葡萄糖+4 μmol/L                           表1 PCR引物序列及产物长度
          吴茱萸碱的DMEM完全培养基。                                     目的基因  正向引物（5′→3′）       反向引物（5′→3′）      产物长度/bp
          2.2 细胞存活率检测                                         AGE   CTACCCTGCCACTGGCCCCTAT  AGCATGGCGAGGCACCACTC  383
              采用 CCK-8 法检测。取对数生长期细胞，按“2.1”                    RAGE  GTGTCCTTCCCAACGGCTC  ATTGCCTGGCACCGGAAAA  280
                                                              NF-кB p65  GATCAATGGCTACACAGGACCA  GTCCTCTTTCTGCACCTTGTCA  551
          项下方法分组、处理，并设置不含细胞、不含药物的空白                           MMP-2  TCAAGTTCCCCGGCGATG  AGTTGGCCACATCTGGGTTG  139
          组。培养 24 h 后，每孔加入 CCK-8 试剂 10 μL，于 37 ℃              MMP-9  AGACCTGGGCAGATTCCAAAC  CGGCAAGTCTTCCGAGTAGT  114
          下孵育 2 h，使用酶标仪于 450 nm 波长处检测各孔的吸                     GAPDH  TGTTCGTCATGGGTGTGAAC  ATGGCATGGACTGTGGTCAT  462
          光度（A）值，并按下式计算细胞存活率：细胞存活率                           2.7 细胞中相关蛋白表达检测
         （%）＝（A 实验组－A 空白组 ）/（A 对照组－A 空白组 ）×100%。                 采用 Western blot 法检测。取对数生长期细胞，按
          2.3 细胞凋亡情况检测                                      “2.1”项下方法分组、处理。培养 24 h 后，收集细胞，用
              采用流式细胞术检测。取对数生长期细胞，按“2.1”                      RIPA 裂解液提取总蛋白，以 BCA 法测定蛋白浓度后进
          项下方法分组、处理。培养24 h后，收集细胞，用磷酸盐                        行加热变性。取变性蛋白，经 12% 十二烷基硫酸钠-聚
          缓冲液（PBS）洗涤后，加入 binding buffer 100 μL 重悬；           丙烯酰胺凝胶电泳分离并转移到聚偏二氟乙烯膜上，用
          随后，依次加入 Annexin Ⅴ-FITC 染液 5 μL 和 PI 染液 5           5% 脱脂牛奶封闭 1 h；洗膜后，加入 AGE、RAGE、p-NF-
          μL，于室温下避光孵育 15 min，使用流式细胞仪检测细                      κB p65、NF-κB p65、MMP-2、MMP-9、GAPDH 一抗（稀
          胞凋亡情况。                                             释比例均为1∶1 000），于4 ℃下孵育过夜；洗膜后，加入
          2.4 细胞迁移能力检测                                       相应二抗（稀释比例为1∶2 000），于室温下孵育2 h；使用
              采用划痕实验检测。取对数生长期细胞，培养，待                         化学发光试剂显色并置于凝胶成像仪下成像。以
          其融合至 90% 后，用 200 μL 移液器枪头在各孔底部中                    GAPDH 为内参，使用 Image J 软件量化 AGE、RAGE、
          央划一直线，用 PBS 清洗后，将细胞按“2.1”项下方法分                     MMP-2、MMP-9 蛋白的表达水平，并记录 p-NF-κB p65
          组、处理。分别于培养0、24 h时使用显微镜观察各组细                        与 NF-κB p65 蛋白的条带灰度值比值（即 NF-κB p65 蛋
          胞的划痕宽度，并按下式计算划痕愈合率：划痕愈合率                           白的磷酸化水平）。
         （%）＝（0 h时的划痕宽度－24 h时的划痕宽度）/0 h时的                    2.8 统计学方法
          划痕宽度×100%。                                             使用 GraphPad Prism 9.0 软件对数据进行统计分
          2.5 细胞侵袭能力检测                                       析。数据以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分
              采用Transwell实验检测。取对数生长期细胞，以不                    析 ，进 一 步 两 两 比 较 采 用 SNK-q 检 验 。 检 验 水 准
          含血清的DMEM培养基重悬，制成5×10 个/mL的单细                       α＝0.05。
                                             5
          胞悬液。取上述单细胞悬液 0.25 mL，接种于预先用基                       3 结果
          质胶处理 5 h 的 Transwell 小室上层；取含 10% 胎牛血清              3.1 吴茱萸碱对高糖诱导的滋养层细胞存活率的影响
          的 DMEM 培养基 600 μL，置于小室下层。上室细胞按                         与对照组[（98.14±4.18）%]比较，高糖组细胞的存
         “2.1”项下方法分组、处理。培养24 h后，收集穿膜细胞，                      活率[（67.32±3.42）%]显著降低（P＜0.05）；与高糖组比
          用4%多聚甲醛固定20 min，再以0.1%结晶紫染液染色                      较 ，吴 茱 萸 碱 低 、高 浓 度 组 细 胞 的 存 活 率 [（78.59±
          10 min，使用显微镜观察侵袭细胞（呈紫色）并计数。                        3.67）%、（88.25±3.85）%]均显著升高，且吴茱萸高浓度
          2.6 细胞中相关mRNA表达检测                                  组的改善效果显著优于低浓度组（P＜0.05）；与吴茱萸
              采用 qRT-PCR 法检测。取对数生长期细胞，按                      碱 高 浓 度 组 和 pc-NC 组 [（87.69±3.73）% ] 比 较 ，pc-
         “2.1”项下方法分组、处理。培养24 h后，收集细胞，使用                      RAGE 组 细 胞 的 存 活 率 [（80.41±3.54）% ] 显 著 降 低
          TRIzol 试剂提取其总 RNA，检测其纯度和浓度后，使用                    （P＜0.05）。
          反转录试剂盒将 RNA 反转录为 cDNA，然后以此 cDNA                    3.2 吴茱萸碱对高糖诱导的滋养层细胞凋亡的影响
                                                    ®
          为模板进行 PCR 扩增。PCR 反应体系包括 SYBR  Pre‐                     与对照组[（3.76±0.27）%]比较，高糖组细胞的凋亡
                   TM
          mix Ex Taq （2×）10 µL、PCR 正向引物（10 µmol/L）0.8        率[（21.64±2.19）%]显著升高（P＜0.05）；与高糖组比

          中国药房  2024年第35卷第12期                                              China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 12    · 1465 ·
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