Page 26 - 《中国药房》2024年12期
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药物递送系统的药效不仅取决于内吞量，还与胞内                          京百灵威科技有限公司；乙腈（批号 B2211267，纯度≥
          转运途径显著相关         [1―2] 。传统观点认为，配体修饰的主               99.9%）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；胎牛血
          动靶向制剂会以配体-受体复合物的形式共同内吞入                             清（批号2282897RP）购自美国Gibco公司；RPMI1640培
          胞，在早期内吞体（early endosome，EE）的偏酸性环境                   养基（批号 L0403400）购自中科迈晨（北京）科技有限公

          下，配体与受体解离，受体会循环返回至膜表面进行下                            司；牛血清白蛋白（BSA）、0.25% 的胰蛋白酶消化液、抗
          一轮的循环，而配体与主动靶向制剂则继续转运进入晚                            荧光衰减封片剂、4%组织细胞固定液、曲拉通X-100（批
          期内吞体（late endosome，LE）/溶酶体中降解         [3―4] 。然而，    号 分 别 为 1218Q057、20210201、20221114、20201224、
                                                                                                            TM
          转铁蛋白受体（transferrin receptor，TfR）介导的细胞内吞             112K022）均购自北京索莱宝科技有限公司；CellMask
          是一个特例：转铁蛋白（transferrin，Tfn）与TfR在胞外结                 橙色细胞质膜染色剂（批号2549243）购自赛默飞世尔科
                             2+
          合后，会以TfR-Tfn-Fe 复合物的形式内吞入胞，EE仅释                     技（中国）有限公司；兔源 Rab5、Rab11B 多克隆抗体（货
              2+
          放 Fe ，使复合物转变为受体-脱铁蛋白形式，而配体和                         号分别为 ab13253、ab3612）和兔源 Rab7 单克隆抗体（货
                                                                                    ®
          受体并未解离，剩下的脱铁蛋白仍会与受体以复合物的                            号 ab126712）、Alexa Fluor  647 标记的驴抗兔 IgG H&L
          形式共同转运返回至膜表面，在遇到胞外的偏中性环境                            二抗（货号ab150075）均购自英国Abcam公司。
                                                 [5]
          时，该复合物会再次将配体释放至胞外基质中 。因此，                           1.3 细胞
          对 TfR 介导的主动靶向递送系统的胞内转运行为进行                              人宫颈癌HeLa细胞购自国家生物医学实验细胞资
          研究，将为该类纳米递送系统的设计提供重要参考。由                            源库。
          于Tfn分子量大，在对纳米载体进行修饰的时候，会导致                          2 方法
          纳米载体粒径变化过大进而影响后续细胞转运机制的                             2.1 两种胶束的制备
          考察。转铁蛋白靶向肽 T7（transferrin-targeting peptide         2.1.1 PEG-PCL-C6胶束
          T7，7pep）是一种通过噬菌体展示技术筛选得到的短                              茄形瓶中加入PEG2000-b-PCL5000乙腈溶液（2 mg/mL）

          肽，能够与 TfR 特异性结合，被广泛用作构建肿瘤靶向                         和 C6 乙腈溶液（1 μg/mL）各 2 mL，于 40 ℃下避光旋转
          药物递送系统的配体          [6―8] 。基于此，本研究以香豆素-6             蒸发至茄形瓶底部出现荧光薄膜，将薄膜温度升至60 ℃
         （coumarin-6，C6）为荧光指示探针，通过薄膜分散法制                      后，加入 60 ℃的磷酸盐缓冲液（PBS）2 mL，涡旋 4 min，
          备 包 载 有 C6 的 聚 乙 二 醇 - 聚 己 内 酯（polyethylene         超声5 min，过0.22 μm滤膜，即得PEG-PCL-C6胶束。
          glycol-polycaprolactone，PEG-PCL）胶 束（简 称“PEG-        2.1.2 7pep-PEG-PCL-C6胶束
          PCL-C6胶束”）或靶头7pep修饰的PEG-PCL胶束（简称                        茄形瓶中依次加入 7pep-PEG2000-b-PCL5000乙腈溶液
         “7pep-PEG-PCL-C6 胶束”），然后观察靶头 7pep 修饰对               （0.672  mg/mL）1.2  mL、PEG2000-b-PCL5000 乙 腈 溶 液（2
          PEG-PCL 胶束在人宫颈癌 HeLa 细胞内转运行为的影                      mg/mL）1.7 mL 以及 C6 乙腈溶液（1 μg/mL）2 mL，其他
          响，以期为主动靶向纳米给药系统的设计与研发，以及                            步骤同“2.1.1”项，即得7pep-PEG-PCL-C6胶束。
          相关细胞机制研究提供参考。                                       2.2 胶束粒径、多分散指数测定及外观形态观察
          1 材料                                                    利用激光粒度仪，釆用动态光散射法测定 PEG-
          1.1 主要仪器                                            PCL-C6胶束或7pep-PEG-PCL-C6胶束的粒径及多分散
              本研究所用主要仪器包括 191L 型气套式 CO2培养                     指数（polymer dispersity index，PDI），设定激光束波长为
          箱（美国CTI公司）、FDU-2110型冷冻干燥机（上海爱朗                      633 nm，入射光与散射光束的夹角为 90 °，测定温度为
          仪器有限公司）、TCS SP8 型激光共聚焦显微镜（德国                        25 ℃，循环数为“自动”。采用透射电镜法观察两种胶束

          Leica 公司）、Nano-ZS90 型激光粒度仪（英国 Malvern 公             的外观形态，取胶束的水分散液5 μL，轻轻滴于铜网上，
          司）、LC-20AT型高效液相色谱仪（日本Shimadzu公司）、                   静置10 min，吸干铜网表面多余的液体，负染、晾干后观
          N-1300 型旋转蒸发仪（日本东京理化器械株式会社）、                        察并拍照。
          JEM-2100PLUS型透射电镜（日本JEOL公司）。                        2.3 胶束细胞内转运行为的考察
          1.2 主要药品与试剂                                         2.3.1 HeLa细胞对胶束的实时摄取观察
              PEG2000-b-PCL5000（ 批 号 MKCM9500）购 自 德 国             将 HeLa 细胞以每孔 6.0×10 个的密度接种到共聚
                                                                                          5
          Merck 公司；7pep-PEG2000-b-PCL5000 （批号 20231222）由济     焦玻底小皿中，置于37 ℃的细胞培养箱中孵育过夜，加
                                                                                 TM
          宁医学院药学院实验室自制；C6（批号LT60P69）购自北                       入 500 μL 的 CellMask  橙色细胞质膜染色剂，染色 10

          · 1432 ·    China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 12                            中国药房  2024年第35卷第12期
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