Page 76 - 《中国药房》2024年10期

2.3 细胞增殖检测 以 Image J 软件定量各组细胞 ROS 的平均荧光强度
采用MTT法检测。取传代后的MC3T3-E1细胞，接 （mean fluorescence intensity，MFI），MFI 越高，表示 ROS
种在 96 孔板中培养至对数生长期，按照“2.2”项下方法 水平越高。
分组处理 24 h 后，再按照“2.1”项下方法检测各组细胞 2.8 细胞中抗氧化酶活性与炎症因子水平检测
活力。 取传代后的MC3T3-E1细胞，接种在24孔板中培养
2.4 细胞凋亡检测 至对数生长期，按照“2.2”项下方法分组处理 24 h 后，用
采用 TUNEL 染色法检测。取传代后的 MC3T3-E1 RIPA 缓冲液在冰水浴中裂解后离心（4 ℃、3 000 r/min、
细胞，接种在24孔板中培养至对数生长期，按照“2.2”项 15 min），得到各组细胞样品液。采用 BCA 法测定各组
下方法分组处理 24 h 后，用磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗 2 细胞样品液中的蛋白总浓度后，每组取 300 μL，按照
次，加入 4% 多聚甲醛固定；然后加入 TUNEL 染色液覆 SOD、CAT测试盒和IL-6、IL-1β ELISA试剂盒说明书中
没细胞，按照 TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒说明书中的
的方法测定各组细胞中 SOD、CAT 活性和 IL-6、IL-1β
方法对凋亡细胞进行染色，用 4′，6-二脒基-2-苯基吲哚 水平。
（DAPI）染液染色细胞核，用 PBS 漂洗后置于荧光显微 2.9 细胞中 FoxO3/Wnt/β-catenin 信号通路相关蛋白
镜下观察并采集图像。采用Image J软件定量各组凋亡 表达检测
细胞数和总细胞数（TUNEL 染色的凋亡细胞显示绿色 采用免疫印迹法检测。取传代后的 MC3T3-E1 细
荧光，DAPI 染色的活细胞显示蓝色荧光），并依据公式
胞，接种在 6 孔板中培养至对数生长期，按照“2.2”项下
计算细胞凋亡率：细胞凋亡率＝凋亡细胞数/总细胞数×
方法分组处理 24 h 后，用 RIPA 缓冲液在冰水浴中裂解
100%。
并提取总蛋白，采用 BCA 法测定各组细胞总蛋白浓度
2.5 细胞中ALP活性检测
后，每组取20 µg蛋白样本上样、电泳、分离、转膜，用5%
采用 ALP 活性测试盒检测。取传代后的 MC3T3-
脱脂牛奶封闭后，加入 FoxO3、Wnt、β-catenin、GAPDH
E1细胞，接种在24孔板中培养至对数生长期，按照“2.2”
一抗（稀释比例均为1∶1 000）和HRP标记的驴抗兔二抗
项下方法分组处理24 h后，更换不含药物的新鲜培养基
（稀释比例为1∶5 000），用化学发光试剂进行显色，采集
继续培养，每隔 2 d 换一次且每次更换前均以终浓度为
各组蛋白条带图像。用 Image J 软件定量其灰度值，以
400 μmol/L 的 H2O2处理 3 h。7 d 后用 RIPA 缓冲液在冰
目的蛋白与内参蛋白（GAPDH）的灰度值比值表示目的
水浴中裂解后离心（4 ℃、3 000 r/min、15 min），得到各组
蛋白的表达水平。
细胞样品液。采用BCA法测定各组细胞样品液中的蛋
2.10 统计学分析
白总浓度后，每组取 150 μL，按照 ALP 活性测试盒说明
采用 GraphPad Prism 8 软件对数据进行统计分析。
书中的方法测定各组细胞中ALP活性。
计量资料以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分
2.6 细胞中钙结节检测
析，两两比较采用SNK-q检验。检验水准α＝0.05。
采用茜素红S染色实验检测。取传代后的MC3T3-
3 结果
E1细胞，接种在24孔板中培养至对数生长期，按照“2.2”
3.1 梓醇最佳作用浓度筛选结果
项下方法分组处理24 h后，更换不含药物的新鲜培养基
如图 1 所示，25、50、100、200、300 μmol/L 梓醇均可
继续培养，每隔 2 d 换一次且每次更换前均以终浓度为
升高 H2O2诱导后的 MC3T3-E1 细胞活力（P＜0.05），且
400 μmol/L 的 H2O2处理 3 h，21 d 后用 PBS 漂洗 2 次，然
后加入4%多聚甲醛固定。加入0.1%茜素红S染色液覆 梓醇浓度为100 μmol/L时对细胞活力的升高作用最强；
没细胞，染色 3～5 min，随后用 PBS 清洗 2 次，采用显微 另外 100 μmol/L 梓醇对正常培养的 MC3T3-E1 细胞无
镜观察并采集图像；再加入10%氯化十六烷基吡啶溶解 毒性。因此选择100 μmol/L梓醇进行后续实验。
染色后的钙结节，最后在 562 nm 波长处测定 OD 值，对 150 300 a a a
各组细胞中钙结节进行定量。 100 a 200 a a
2.7 细胞中ROS水平检测 细胞活力/% 50 细胞活力/% 100
采 用 DCFH-DA 荧 光 探 针 检 测 。 取 传 代 后 的 0 0
MC3T3-E1 细胞，接种在 24 孔板中培养至对数生长期， 0 50 100 150 200 250 300 0 50 100 150 200 250 300
梓醇浓度/（μmol/L） 梓醇浓度/（μmol/L）
按照“2.2”项下方法分组处理 24 h 后，用 PBS 冲洗 2 次， A.梓醇对MC3T3-E1细胞活力的 B.梓醇对H 2O 2诱导后MC3T3-E1
影响 细胞活力的影响
然后加入 10 μmol/L DCFH-DA 荧光探针，室温下孵育 a：与0 μmol/L梓醇比较，P＜0.05。
30 min，用 PBS 冲洗 2 次，采用显微镜观察并采集图像。 图1 梓醇最佳作用浓度筛选结果

· 1222 · China Pharmacy 2024 Vol. 35 No. 10 中国药房 2024年第35卷第10期