Page 75 - 《中国药房》2024年10期
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大危害 [1―2] 。成骨细胞是骨组织中具有成骨潜能的功能 0.1%茜素红S染色液（批号分别为C0001、B1127）均购自
细胞，而活性氧（reactive oxygen species，ROS）过量产生 北京普利莱基因技术有限公司；2′，7′-二氯荧光素二乙酸
诱发的氧化应激及慢性炎症，可导致成骨细胞形成减 酯（2′，7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）
少，最终因骨量丢失而造成骨质疏松 [3―4] 。清除 ROS 并 荧光探针（批号 SS1967）购自范德（北京）生物科技有限
进行抗氧化、抗炎治疗是改善骨质疏松的有效手段。叉 责任公司；兔源抗小鼠FoxO3、Wnt、β-catenin、甘油醛-3-
头框蛋白O3（forkhead box O3，FoxO3）可通过失活Wnt/ 磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，
β-连环蛋白（β-catenin）信号来抑制人骨髓间充质干细胞 GAPDH）一抗和辣根过氧化物酶（horseradish peroxi‐
增殖和成骨分化，进而通过干扰骨代谢和骨骼形成来介 dase，HRP）标记的驴抗兔二抗（批号分别为 ab70315、
导股骨头坏死的发生发展 。中老年人患股骨头坏死的 ab15251、ab6301、ab8245、ab6802）均购自英国 Abcam 公
[5]
常见原因之一就是骨质疏松，故推测FoxO3可能通过失 司等。
活 Wnt/β-catenin 信号来介导骨质疏松的进程。已有研 1.3 细胞
究显示，蒙药蓝刺头和黄芪甲苷可通过下调 FoxO3a 表 小鼠成骨细胞 MC3T3-E1 购自长沙艾碧维生物科
达和增强Wnt/β-catenin信号活性来抵抗氧化应激，促进 技有限公司。
成骨细胞生成，进而增加骨量，改善骨质疏松症状 [6―7] 。 2 方法
由此可知，FoxO3/Wnt/β-catenin信号通路可能是防治骨 2.1 细胞体外培养及梓醇最佳作用浓度筛选
质疏松的潜在作用靶点。 MC3T3-E1细胞快速解冻后，于α-MEM完全培养基
梓醇是一种环烯醚萜葡萄糖苷类化合物，主要存在 （α-MEM 基础培养基+10% 胎牛血清+1% 双抗）中复苏
于地黄等植物中，具有很强的抗炎和抗氧化活性，对于 培养，传代2次后接种在2个96孔板中培养至对数生长
[8]
关节炎、牙周炎等炎症性疾病具有治疗作用 ，但其作用 期，采用终浓度分别为0、25、50、100、200、300 μmol/L的
机制尚不明确。本研究以 H2O2诱导建立成骨细胞氧化 梓醇处理细胞 24 h ，每个浓度设置 6 个复孔，另外随机
[9]
应激模型，探究梓醇调节FoxO3/Wnt/β-catenin信号通路 选一板细胞以终浓度为400 μmol/L的H2O2处理3 h诱导
对H2O2诱导成骨细胞损伤的影响，旨在为发现骨质疏松 建立成骨细胞氧化应激模型（于梓醇处理 21 h 后加入
新的治疗靶点及开发新的治疗药物提供参考。 H2O2 ） ；然后均以含 20 μL MTT 工作液的新鲜培养基
[10]
1 材料 培养 2 h，按照 MTT 细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒说
1.1 主要仪器 明书方法测定细胞光密度（optical density，OD）值，以 0
本研究所用主要仪器包括EnVision Nexus型多功能 μmol/L 梓醇（加入等体积二甲基亚砜）处理细胞的培养
酶标仪[瑞孚迪生物医学（上海）有限公司]，PowerEase 孔为对照组，以不接种细胞、不加梓醇的培养孔为空白
Touch 型电泳仪电源、XCell Ⅱ 转印模块、Mini Gel 组，依据公式计算细胞活力：细胞活力＝（梓醇处理组
TM
TM
Tank 型小型垂直电泳系统、XCell SureLock 型小型转 OD 值－空白组 OD 值）/（对照组 OD 值－空白组 OD
印槽[赛默飞世尔科技（中国）有限公司]，MF53-N型倒置 值）×100%。根据细胞活力筛选对H2O2诱导MC3T3-E1
荧光显微镜（广州市明美光电技术有限公司）等。 细胞活力升高作用最强且对正常培养细胞无毒性的浓
1.2 主要药品与试剂 度作为梓醇最佳作用浓度进行后续实验。
梓醇对照品（纯度99.6%，批号110808-202313）购自 2.2 细胞分组及处理
中国食品药品检定研究院；空载质粒、FoxO3 过表达质 MC3T3-E1 细胞随机分为对照组、模型组、空载组、
粒（批号分别为230206、230312）均购自北京靖瑞百康生 梓醇组、梓醇+FoxO3 过表达组，每组 6 个复孔。空载组
物 技 术 有 限 公 司 ；超 氧 化 物 歧 化 酶（superoxide dis‐ 细胞转染空载质粒，梓醇组细胞以终浓度为100 μmol/L
mutase，SOD）测试盒、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase， 的梓醇处理，梓醇+FoxO3过表达组细胞以终浓度为100
ALP）活性测试盒、过氧化氢酶（catalase，CAT）测试盒、 μmol/L 的梓醇处理的同时转染 FoxO3 过表达质粒。转
MTT 细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒及小鼠白细胞介 染步骤参照脂质体2000说明书进行，转染剂量按照质粒
素 6（interleukin-6，IL-6）、IL-1β 酶 联 免 疫 吸 附 测 定 说明书中要求设定。除对照组细胞不作处理外，其余各
（ELISA）试 剂 盒（批 号 分 别 为 JLCS1454、JLCS1192、 组细胞处理后按照“2.1”项下方法以H2O2诱导建立成骨
JLCS1166、JLC3377、JLC3601、JLC3580）均购自上海晶 细胞氧化应激模型，各组细胞均在处理24 h后进行后续
抗生物工程有限公司；TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒、 检测。
中国药房 2024年第35卷第10期 China Pharmacy 2024 Vol. 35 No. 10 · 1221 ·
