Page 61 - 《中国药房》2024年10期
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2.2 OA干预浓度的筛选                                      法计算细胞中 TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA 表达水平。各
              采用 MTT 法检测。取对数生长期的 RAW264.7 细                  目的基因引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司
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          胞，以 5×10 个/mL 接种到 96 孔板中，每孔 100 μL。待               根据设计合成，引物序列及产物大小见表1。
          细胞贴壁后加入不同浓度的 OA，在无 LPS 刺激和有                                    表1 引物序列及产物大小
          LPS 刺激条件下分别测定细胞存活率，考察不同浓度                           基因  正向引物序列（5′→3′）      反向引物序列（5′→3′）     产物大小/bp
          OA 对 RAW264.7 细胞增殖的影响。设置对照组[0.5%                    TNF-α  GGACTAGCCAGGAGGGAGAACAG  GCCAGTGAGTGAAAGGGACAGAAC  103
                                                              IL-6  ACTTCCATCCAGTTGCCTTCTTGG  TTAAGCCTCCGACTTGTGAAGTGG  141
          二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）]、无LPS刺激的             IL-1β  TCGCAGCAGCACATCAACAAGAG  TGCTCATGTCCTCATCCTGGAAGG  118
          OA 组、单用 LPS 刺激组、有 LPS 刺激的 OA 组。无 LPS                β-actin GTGCTATGTTGCTCTAGACTTCG  ATGCCACAGGATTCCATACC  174
          刺激的 OA 组细胞培养 24 h 后，加入不同浓度 OA（7.5、                 2.6 细胞中NF-κB、Nrf2通路相关蛋白表达的检测
          15、30、60、80 µmol/L，浓度根据预实验结果设置），有                      采用蛋白免疫印迹法检测。细胞分组及给药方法
          LPS 刺激的 OA 组细胞先用 1 μg/mL LPS 刺激 1 h 后，再            同“2.3”项。各组细胞经药物作用 24 h 后，收集各组细
          加入不同浓度 OA（0、7.5、15、30 µmol/L，浓度根据无                 胞，加入含有蛋白酶抑制剂的裂解液冰浴解裂提取细胞
          LPS刺激的OA组MTT实验结果设置），每个浓度设3个                        总蛋白，定量蛋白浓度，煮沸变性后，通过10%十二烷基
          复孔，混合培养 24 h。另设不含细胞、不含 OA，仅含                       硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜；用无蛋白快速封闭
          0.5%DMSO的空白组。每孔加入MTT溶液20 µL，继续                     液封闭 15 min 后，分别加入 β-actin、IκBα、p-IκBα、NF-
          培养 4 h，吸弃上清液，随后每孔中再加入 DMSO 150                     κB p65、p-NF-κB p65、Keap1、NQO1、HO-1、Nrf2 一抗
          µL，避光振荡10 min，用酶标仪在490 nm波长处测定各                   （稀释比例均为 1∶1 000），4 ℃孵育过夜；用 TBST 缓冲
          孔的光密度（optical density，OD）值，并计算细胞存活率：               液洗膜3次，加入荧光二抗（稀释比例为1∶10 000），室温
          细 胞 存 活 率（%）＝（OD 给药组 －OD 空白组 ）/（OD 对照组 －           下避光孵育 1 h，TBST 缓冲液洗涤后，用双色红外激光
          OD 空白组 ）×100%。                                     成像仪成像。用 Image J 软件分析蛋白条带灰度值，以
          2.3 细胞中NO和ROS含量的检测                                 目的蛋白与内参蛋白（β-actin）的灰度值比值表示目的蛋
              采用Griess法和流式细胞术检测。将RAW264.7细                   白的表达水平。
          胞以 1×10 个/mL 接种到 6 孔板中，每孔 1 mL。设置对                 2.7 细胞中NF-κB p65和Nrf2蛋白定位观察
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          照组（0.5%DMSO）、LPS 组（1 μg/mL LPS）、DEX 组（10               采用细胞免疫荧光法检测。将 RAW264.7 细胞以
          μmol/L DEX+1 μg/mL LPS，浓度根据预实验结果设置）                1.5×10 个/mL 接种到 24 孔板内的无菌盖玻片上，待
                                                                    5
          和OA低、中、高浓度组（7.5、15、30 µmol/L OA+1 μg/mL            24 h 细胞贴壁后，分为对照组（0.5%DMSO）、LPS 组
          LPS，浓度根据“2.2”项下结果设置），每组设 3 个复孔。                   （1 μg/mL）、OA高浓度组（30 µmol/L OA+1 μg/mL LPS），
          除对照组外，其余各组先用LPS刺激1 h后，再与药物混                        每组设 3 个复孔。除对照组外，其余各组细胞先用 LPS
          合培养24 h。收集各组细胞上清液100 μL，按照试剂盒                      刺激1 h后，再与药物混合培养24 h。收集各组细胞，用
          说明书方法检测 NO 含量。收集各组细胞，加入 10                         4%多聚甲醛固定30 min，随后用0.5%Triton X-100通透
          µmol/L 2′，7′-二氯荧光素二乙酸酯工作液 1 mL，37 ℃                20 min，并用 10% 山羊血清室温封闭 1 h，加入 NF-κB
          避光孵育30 min，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3次，加入                     p65、Nrf2一抗（稀释比例分别为1∶3 000、1∶200），4 ℃孵
          PBS 500 µL重悬细胞，然后立即用流式细胞仪检测ROS                     育过夜；用PBS洗涤3次，加入相应的荧光二抗（稀释比
          含量。                                                例均为1∶250），室温避光孵育1 h；用PBS洗涤3次，加入
          2.4 细胞形态的观察与细胞中炎症因子含量的检测                           4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）避光孵育 10 min，用
              细胞分组及给药方法同“2.3”项。各组细胞经药物                       PBS 洗涤后，封片，在荧光显微镜下观察并拍照（NF-κB
          作用 24 h 后，将细胞培养板置于倒置显微镜下，拍照并                       p65蛋白呈绿色荧光，Nrf2蛋白呈红色荧光，细胞核呈蓝
          分析各组细胞形态的变化情况。随后收集各组细胞上                            色荧光）。
          清液，根据 ELISA 试剂盒说明书方法检测上清液中                         2.8 统计学方法
          TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-4和IL-10含量。                         采用SPSS 27.0软件对数据进行统计分析。数据以
          2.5 细胞中TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA表达的检测                  x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两
              采用实时荧光定量 PCR 法检测。细胞分组及给药                       比较时，若方差齐采用 LSD-t 检验，若方差不齐则采用
          方法同“2.3”项。各组细胞经药物作用24 h后，收集各组                      Dunnett’s T3检验。检验水准α＝0.05。
          细胞，根据试剂盒提取总 RNA，测定其浓度，对 RNA 进                      3 结果
          行定量后反转录成cDNA，然后进行PCR扩增。PCR扩                        3.1 OA干预浓度的筛选结果
          增条件为95 °C预变性30 s；95 °C变性5 s，60 °C退火延                   与对照组比较，在无LPS刺激条件下，60、80 μmol/L
          伸 30 s，共循环 40 次。以 β-actin为内参基因，使用 2         －ΔΔCt  OA 均能显著降低细胞存活率（P＜0.05），而 7.5、15、30


          中国药房  2024年第35卷第10期                                              China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 10    · 1211 ·
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