Page 50 - 《中国药房》2024年9期
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1.3 实验动物与饲料 2.5.1 样本质控分析
42只健康清洁级雄性Wistar大鼠（220～240 g）购自 （1）肝脏样本蛋白的提取。在冷冻状态下取出样
哈尔滨医科大学，实验动物生产许可证号为SCXK（黑） 本，转移至振荡管中；加入适量含蛋白酶抑制剂的蛋白
2018-003。大鼠饲养于黑龙江中医药大学动物实验中 裂解液（8 mol/L尿素+1%SDS）；组织研磨仪上振荡研磨
心。本实验方案通过黑龙江中医药大学实验动物伦理 3次，每次40 s；冰上裂解30 min，每5 min漩涡混匀1次，
委员会批准（批件号为2021012802），并严格按照伦理委 时长为 10 s；以 16 000 r/min 离心 30 min，温度设置为
员会批准方案实施。高脂饲料购自北京科澳协力饲料 4 ℃，取上清液备用。（2）BCA法定量蛋白质浓度。应用
BCA 蛋白检测试剂盒，并按照要求操作，用酶标仪测得
有限公司，由基础饲料、蔗糖、猪油、胆固醇、胆酸钠组
562 nm 波长处的吸光度，绘制标准曲线并计算样本浓
成，含量分别为67%、20%、10%、2.5%、0.5%。
度。（3）SDS-PAGE。对9个样本进行SDS-PAGE（上样量
2 方法
为 15 μg）。（4）样本处理和液相串联质谱检测。①取
2.1 分组、造模与给药
100 μg蛋白样本，用裂解液补充体积至90 µL，分别加入
42 只大鼠在经过 7 d 适应性喂养后，分为空白组
终 浓 度 100 mmol/L 的 TEAB 和 终 浓 度 10 mmol/L 的
（n＝14）和高脂组（n＝28）。空白组大鼠给予基础饲料
TCEP，置于 37 ℃下反应 1 h，再加入终浓度 40 mmol/L
喂食，高脂组大鼠给予高脂饲料喂食。于第8周末检测
的碘乙酰胺，避光条件下室温反应 40 min；各管分别加
造模大鼠的血脂水平，参考第4版《药理实验方法学》中
入6倍体积的预冷丙酮，置于－20 ℃条件下沉淀4 h，然
标准，当血脂四项中有一项水平异常，则认为造模成功。
后以16 000 r/min离心20 min；弃上清液，沉淀用100 µL
高脂组造模成功的大鼠根据体重和血脂水平，随机分为 50 mmol/L的TEAB充分溶解，按照样品质量加入2%胰
模型组、丹参饮组，继续喂养高脂饲料。根据前期研究 蛋白酶，在 37 ℃条件下酶解过夜。②用 TMT 试剂标记
结果，丹参饮临床等效剂量（3.6 g/kg）为最优剂量（药效 肽段并进行等量混合，每 100 µg 多肽加入一管 TMT 试
[9]
学最显著） ，鉴于本研究目的在于探讨丹参饮的对血脂 剂，室温孵育2 h；加入羟胺，室温反应15 min，按顺序分
异常的调节机制，因此采用单一剂量（3.6 g/kg）进行蛋白 别标记 9 个样本。③利用 C18反相色谱柱对肽段进行预
质组学研究。分组后，于第9周开始，丹参饮组大鼠灌胃 分离，用UPLC上样缓冲液复溶多肽样本后用C18反相色
相应药液（以蒸馏水为溶剂，按生药量计，根据临床等效 谱柱进行高pH液相分离。④将分离馏分合并成10个馏
剂量换算而得），空白组和模型组大鼠灌胃等体积生理 分真空离心浓缩后，用质谱上样缓冲液溶解，进行第二
盐水，每天1次，连续4周。 维分析。色谱分离时间为 120 min；流动相 A 为 2% 乙
2.2 样本采集 腈、0.1%甲酸；流动相B为80%乙腈、0.1%甲酸；流速为
大鼠给药第 4 周后禁食、不禁水，在最后一次给药 300 nL/min；质谱扫描范围为 m/z 350～1 300；采集模式
30 min后，腹腔注射1%戊巴比妥钠进行麻醉，在髂主动 为数据依赖型采集，Top 20，输出 raw 文件，进行数据库
脉取血，置于含有枸橼酸钠的抗凝管中，用于血脂水平 搜索。
2.5.2 差异蛋白分析
检测。取大鼠部分肝脏组织于－80 ℃冻存用于蛋白质
经搜库鉴定和波峰分析，获得不同样本中同一蛋白
组学研究，剩余肝脏固定位置切成数块，置于 10% 中性
的表达丰度；再进行样本间蛋白的差异表达分析，筛选
福尔马林中用于病理形态观察。
出样本间的差异蛋白。通过设置显著性差异检验方法
2.3 大鼠血脂水平检测
及蛋白表达量差异倍数，运用统计学方法，获得显著差
采用全自动生化分析仪检测。取“2.2”项下抗凝血
异表达蛋白的信息及差异数据表。
以3 000 r/min离心12 min后获取上层血浆，按相应试剂
2.6 大鼠肝脏组织中EPHX2、PLIN2、GSK-3β、PPARγ
盒说明书要求检测血浆TC、TG、LDL-C、HDL-C水平。
蛋白表达的检测
2.4 大鼠肝脏组织病理形态学检测
采用 Western blot 法检测。每组随机选取 3 个冷冻
采用苏木精-伊红（HE）染色法观察。取“2.2”项下
肝脏组织样本，精密称取100 mg，剪碎，加入组织蛋白裂
固定位置切块的肝脏组织适量，经常规包埋，切片，透 解液，用研磨仪研磨裂解后，以 4 ℃、13 000 r/min 离心
明，脱蜡，脱水，苏木精染色 8 min；水洗后，伊红染色 2 10 min，取上清液，采用BCA蛋白定量法检测蛋白浓度。
min；再次水洗，脱水，透明2次；经中性树胶封片后，置于 加蛋白上样缓冲液，95 ℃煮沸变性，SDS-PAGE分离，将
光镜下观察大鼠肝脏组织的病理形态变化情况。 凝胶中的蛋白转印至PVDF膜上，用封闭液在室温下摇
2.5 TMT定量蛋白质组学分析 床封闭 1 h；添加一抗（EPHX2、PLIN2、GSK-3β、PPARγ
分别从空白组、模型组和丹参饮组中随机选取 3 只 的稀释比例均为 1∶1 000），4 ℃下孵育过夜，TBST 洗膜
大鼠的肝脏样本进行TMT定量蛋白质组学分析。 3次；特异性蛋白与二抗（HRP标记的山羊抗兔IgG稀释
· 1072 · China Pharmacy 2024 Vol. 35 No. 9 中国药房 2024年第35卷第9期
